PCR扩增的原理和操作步骤Word下载.docx
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PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'
端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'
端开始延伸，其5'
端是固定的，3'
端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5'
端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'
端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
变性
延伸
退火
图PCR的反应历程
二、PCR反应的五个元素
参与PCR反应的物质主要为五种：
引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1．引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计有3条基本原则：
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：
若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；
而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
（1）引物长度
PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。
引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；
引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。
（2）引物碱基构成
引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
（3）引物二级结构
引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。
这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。
对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。
引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；
影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。
应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
（4）引物3’端序列
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。
∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。
应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高。
引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
需要注意的是，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
（5）引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：
加酶切位点；
标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；
引入蛋白质结合DNA序列；
引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
（6）引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
2．酶及其浓度
TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。
TaqDNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94000Da。
具有5’-->
3的聚合酶活力，5’-->
3’的外切核酸酶活力，无3’-->
5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点：
（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。
PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；
有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；
还有针对不同实验对象的酶等。
一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u（总反应体积为50μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3．dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。
HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200μmol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
4．模板（靶基因）核酸
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；
蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/μl，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。
在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
5．Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/l时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
一般厂商提供的TaqDNA聚合酶均有相应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液，，在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。
三、PCR反应特点
PCR反应具有以下特点：
1．强特异性
PCR反应的特异性决定因素为：
（1）引物与模板DNA特异性的结合；
（2）碱基配对原则；
（3）TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；
（4）靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
2．高灵敏度
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6g）水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；
在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；
在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3．快速简便
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性－退火－延伸反应，反应一般在2～4小时完成。
扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。
4．低纯度模板
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
第二节PCR扩增反应的实施
一、PCR反应的条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
1．温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。
（1）变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
（2）退火（复性）温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
（3）延伸温度与时间：
TaqDNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃，150核苷酸/S/酶分子；
70℃，60核苷酸/S/酶分子；
55℃，24核苷酸/S/酶分子；
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
（4）PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；
扩增10kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
2．循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
二、PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。
PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
1．凝胶电泳分析：
PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
（1）琼脂糖凝胶电泳：
通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：
6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
2．酶切分析：
根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
3．分子杂交：
分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。
4．Southern印迹杂交：
在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。
此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
5．斑点杂交：
将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
6．核酸序列分析：
是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
三、PCR结果异常分析
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
1．假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有：
①模板核酸的制备；
②引物的质量与特异性；
③酶的质量及活性；
④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
（1）模板：
①模板中含有杂蛋白质；
②模板中含有Taq酶抑制剂；
③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；
④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变：
通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl或100μl,用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μl后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因：
变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;
退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
（7）靶序列变异：
如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2．假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
可能的原因是：
（1）引物设计不合适：
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：
这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：
①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3．出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：
①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
4．出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
①减少酶量，或调换另一来源的酶；
②减少dNTP的浓度；
③适当降低Mg2+浓度；
④增加模板量，减少循环次数。
延伸反应，以获得尽可能完整的产物，
这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4.
循环次数：
当其它参数确定之后，
循环次数主要取决于DNA
浓
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