血管形成的测定方式Word下载.docx

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　　血管内皮细胞的增殖是血管发生的重要步骤。

目前，已有多种成熟的细胞增殖测定方式，如四氮唑盐还原法等。

[3H]胸腺嘧啶掺入法和细胞周期动力学检测法是两种要紧的细胞增殖测定方式。

　　四氮唑盐〔3（4,5dimethylthiazol2yl）2,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT〕还原法，又称MTT比色法，是一种最经常使用的检测细胞存活和生长的方式。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

MTT结晶形成量与细胞数成正比。

该方式已被用于检测活细胞增殖，并普遍用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物挑选、细胞毒性实验和肿瘤放射灵敏性测定等[5]。

　　与之相较，[3H]胸腺嘧啶掺入法是一种更好的测定细胞增殖的方式。

将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）作为DNA合成的前体掺入到增殖细胞中,通过放射自显影观看细胞增殖情形。

传统的以5溴脱氧尿苷（BrdU）作为核苷酸取代胸腺嘧啶掺入到新生成细胞的DNA中，通过用单克隆抗体检测与DNA结合的BrdU，反映细胞增殖状态的方式，尽管较以上方式有所进步，但其仍或多或少的受外源性示踪物的阻碍[6]。

同时细胞增殖的转变可能是由细胞毒性而非测试药物的阻碍作用，因此结合细胞增殖测定法和细胞凋亡检测法的特点，可能会取得更为精准的结果。

　　内皮细胞迁移测定法

　　目前，对血管内皮细胞迁移的阻碍，已经有很多有效的测定方式。

其中以改良的BoydenChamber或Transwell法最经常使用[7]。

这些方式均是通过观测穿过必然孔径（如8μm）硝酸纤维素薄膜的细胞数量,确信细胞迁移能力。

最近几年来尽管又有新型MillicellHA底膜培育皿式双室联合培育系统显现,可是它们的原理一样,利用细胞穿过微孔滤膜来观测一种细胞对另一种细胞迁移的阻碍。

　　划痕损伤的方式在国外显现较早。

用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培育皿上划痕，为边缘内皮细胞迁移提供一袒露区域。

通过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并从头形成新的单层内皮细胞层。

在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离，并计算出细胞的实际迁移距离。

但是这种方式的定量具有任意性。

　　成管测定法

　　血管形成中最典型的测定是对内皮细胞形成三维结构能力的测定。

在体外给予适合的细胞外基质成份，内皮细胞能形成管状结构。

在含有胶原和纤维蛋白凝块的塑料培育皿中，内皮细胞初期在水平面形成细胞条索结构，通过12h或更长时刻培育，细胞条索开始向上发出分支，贯穿凝胶形成三维的管状网络结构[8]。

在一系列的血管发生测定中，成管测定占有重要的位置[9,10]。

内皮细胞不仅能在二维空间形成毛细管，也能在三维空间对细胞行为进行定量分析，这更为接近体内细胞生长的环境。

定量分析包括在凝胶中从下到上对不同长度管进行拍照，测量每一个管的长度（水平面上的宽度和垂直面的高度）和管的最大直径等。

　　器官培育测定法

　　器官培育方式极大地推动了对血管形成的测定。

器官血管形成测定法包括鼠主动脉环、鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎儿鼠骨移植测定法等。

这些测定法超级相似，其中鼠主动脉环测定应用最为普遍。

在体外，通常把分离的器官片段、胎盘或部份器官放于含有待检测物质的基质（如纤维）中培育，10～14d后，可检测内皮细胞生长形成血管，通过测量移植体的长度和形成微血管的数量来定量测定血管的发生[11]。

但是，血管定量测定也超级困难，因为微血管的向外生长老是成簇在一路，因此它们所覆盖的区域就很难测定。

　　2血管形成的体内测定方式

　　以上表达的一系列体外测定方式已被用来研究血管形成的不同方面，但是对不同来源内皮细胞的分离和体外培育发觉，不同来源的血管内皮细胞对各类外界因素的反映不同。

体外培育的内皮细胞行为和形态受到多种实验参数的阻碍：

基质的自然状况、所用培育介质及血清的类型、各类外界因素、搜集细胞的方式和传代次数等。

因此，最近几年来体内实验系统被普遍地重视和应用，而且取得迅速进展。

在以往发表的很多文章中，大量的体内测定法已经被详细的描述过，笔者结合最新的进展作进一步的详述。

　　背侧皮肤/气囊模型测定法

　　背侧皮肤/气囊模型是用来检测药物对由体内癌细胞所触发的新生血管生成反映的阻碍[12]。

用滤纸覆盖微孔环双侧，形成一个腔系，用肿瘤细胞悬浊液填充那个腔系，然后将其植入到麻醉老鼠的经皮下注射形成的皮下气囊中。

用检测物质处置后，将腔室除掉，然后将相同的多聚物环放置在与腔系直接接触的位点。

新生血管形成的反映可通过计数新生血管的数量来检测。

这种检测法相对来讲操作比较简单，但是操作仍需细心，以幸免引发腔系表面血管的形成，因为微孔环本身能诱导新生血管的形成，从而掩盖了由细胞所诱导的新生血管的形成。

　　海绵聚合体植入和基质胶塞测定法

　　在皮下植入包括细胞或血管发生刺激因子的聚合体基质（以海绵或基质胶塞的形式）已经愈来愈多的应用于研究体内血管的发生[13]。

将被检测物直接或制成片剂置于海绵中，通过一系列的方式，如组织学（组织浸润）、形态学（血管密度）、生物化学（DNA、蛋白和血红蛋白的含量）等方式检测新生血管生成[14]。

但是，海绵的大小、形状和组分的不同对实验结果都会有阻碍;

另外，植入能引发非特异性的免役应答，这些免役应答可能自身会致使血管形成的发生。

　　基质胶塞测定法被普遍用于评判生长因子的促血管新生能力,如VEGF[15]。

基质胶是富含层连蛋白的细胞基质,能够诱导和维持多种细胞的分化。

基质胶在4℃时成液态,与各类生长刺激因子混合后注射到小鼠腹部皮下组织,在小鼠正常体温条件下专门快形成固体凝胶,使生长刺激因子缓慢释放。

通过组织学检测，图像分析塞内的血管面积（mm3）或通过检测基质胶中血红蛋白的含量对血管生成进行定量分析。

尽管基质胶比较昂贵，但与人工海绵相较,基质胶提供了血管发生更为自然的微环境。

　　鸡胚绒毛尿囊膜（chickchoriollantoicmembrane，CCM）和卵黄囊（yolksacmembrane，YSM）膜测定法

　　鸡胚绒毛尿囊膜和卵黄囊膜测定法是研究血管形成最经常使用的体内测定法[16]，在很多文章中都有比较详细的描述[17-19]。

目前这两种模型的应用已较成熟，而且普遍用于研究血管生成和抗血管生成中[20]。

CAM模型有侧室开窗法和顶端气室开窗法，开窗暴露出CAM，以明胶海绵、定性滤纸或甲基纤维素作为载体，将药物植入到CAM上,2～3d后就会观看到移植物周围典型的放射状排列的新生血管。

YSM法是对CAM法的改良，将72h鸡胚整体去掉蛋壳，移植到无菌平皿中，如此在YSM发育进程中，能够持续观看血管发生的进程，而且可在更大范围和时刻内定量测定血管的发生。

该方式克服了CAM法难以确信加样部位的缺点，使药品加入部位一致，并可在同一部位多次给药，观看结果简即靠得住。

另外，近20年来，鸡胚尿囊膜移植瘤模型也被用于肿瘤血管形成机制的研究。

这种模型可能是研究肿瘤诱导的血管发生最理想的模型，因为宿主的免疫系统尚未完全成熟，肿瘤种植到尿囊膜上2d内维持无血管的状态，以后新生血管进入肿瘤，而且快速生长，形成丰硕的血管网。

　　鸡胚尿囊膜和卵黄囊膜法技术具有相对操作比较简单、取材方便、无需特殊设备、经济、实验周期短、适合于大规模挑选等优势，又能定性或半定量的检测肿瘤组织、细胞分泌成份及各类生物因子对血管的活性作用，是研究肿瘤生物学特性，专门是肿瘤诱导血管发生的良好模型。

但CAM和YSM本身确实是一个丰硕的血管网络，如此就很难从已存在的血管中区分出新生的毛细血管[22]。

另外，CAM很容易发生炎症反映，对氧压的转变也超级灵敏，因此开窗就成为实验进程中一个超级重要环节。

　　角膜血管形成测定法

　　该测定法被以为是一种最好的定性检测方式。

角膜本身是一个无血管的部位，因此，通过血管发生诱导因子刺激而在角膜中所观看到的血管都是新生血管，如此就能够够幸免其他模型中所存在的原有血管干扰的现象[23]。

　　角膜微囊模型多采纳啮齿动物如兔、鼠的角膜。

将含有诱导血管形成药物的片剂或多聚体植入角膜，使药物缓慢释放，触发新生血管的生成。

检测物质通常以缓慢释放的多聚体或片剂的形式植入到角膜中。

但是许多多聚体检测物成份可能会刺激角膜，引发炎症反映，从而干扰了血管发生的定量测定[24,25]。

目前以聚乙烯海绵为载体给药的方式就幸免或减少了这种阻碍。

实验中，可用运算机图像分析联合黑色墨汁灌注角膜来定量测定新血管发生的反映。

最近，荧光染料标记的高分子量葡聚糖已经普遍的应用于角膜血管发生[24]。

目前，显现了一种非侵袭性的记录整个角膜血管发生进程的方式[23]，运算机图像分析联合运算机图像数据搜集的方式，通过像素计数来计算血管的面积。

　　角膜血管发生测定法的优势是:

角膜本身没有已经存在的血管背景的问题，同时，实验对象比较普遍。

可是与CAM法相较，它具有花费高、技术要求高、不适合进行大规模挑选等缺点。

另外，实验器官涉及到眼，因此研究也面对着伦理道德的问题。

　　肿瘤模型

　　肿瘤模型是用来检测药物抗血管生成和抗肿瘤作用的最终模型,包括人肿瘤模型及动物肿瘤模型。

小鼠Lewis肺癌和黑色素B16等高转移模型是经常使用的动物肿瘤模型,人肿瘤模型最经常使用的是裸鼠异种移植瘤[25]。

利用高转移的裸鼠移植瘤还可同时观看抗血管生成物质的抗肿瘤转移能力。

肿瘤生长超过必然的大小就需要形成新的血管来取得氧气、营养和排除代谢废物,因此一些特殊组织学分析，如血管密度、血流、凝血作用、肿瘤细胞的凋亡或坏死等都可用来作为检测物质对新生血管形成阻碍作用的指标。

　　与CAM模型相较，肿瘤模型更适合研究肿瘤血管的发生。

待测药物的吸收、分派状态、药效等在肿瘤模型上都能取得比较精准的结果。

另外，肿瘤模型也可用来检测新药物是不是具有抗新生血管形成或抗血管生长的作用。

但是,实验所用的肿瘤细胞，专门是经皮下移植的肿瘤细胞与常位生长的肿瘤细胞的生长环境是不同的，这可能会阻碍实验结果。

另外，要检测新血管的形成，最后需要处死实验动物，并需要花费长时刻来预备组织分析，这就不可能进行实时非侵袭性的研究[26]。

　　3结语

　　随着目前一系列潜在的血管形成抑制剂在癌症临床第二、3时期的实验成功,开发新的抗血管药物已经成为医治癌症和其他一些疾病的趋势,而在临床前的研究中，必需找到更为有效、适合的方式来检测癌症抑制剂对癌细胞或血管的抑制成效。

同时，关于一系列的体内、体外测定法，必需熟悉到它们的局限性，才能对结果作出相应的精准的说明。

　　体外测定法的实施是测定待测试物质作用关键性的第一步，给咱们提供了大量有效的信息。

但是，体外与体内环境之间存在着专门大的不同，并非能完全反映体内血管的发生。

因此，要对一种物质在血管形成进程中的作用有充分的明白得和评判，必需利用一种以上的体外测定方式来研究待测物质在血管发生中的作用，然后利用一种以上的体内测定法来验证在体外测定法中所观看到的结果。

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