医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法Word文档格式.docx
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蛋白胨60g
猪胆盐（或牛、羊胆盐）15g
乳糖15g
A2.2.2制法
制法同附录A2.1.2。
伊红美兰培养基（EMB培养基）
A2.3.1成分
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂20g
2％伊红水溶液20mL
％美蓝水溶液13mL
A2.3.2制法
将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解，再加入蒸馏水补足至1000mL，调整pH至～。
趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖，混匀，定量分装于烧瓶内，115℃灭菌20min。
作为储备培养基贮存于冷暗处备用。
临用时，加热融化储备培养基，待冷至60℃左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一定量的已灭菌的2％伊红水溶液和％美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）。
倾注平皿备用。
乳糖蛋白胨培养液
A2.4.1成分
牛肉膏3g
氯化钠5g
％溴甲酚紫乙醇溶液1mL
A2.4.2制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到～，加入％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。
革兰氏染色液
A2.5.1结晶紫染色液
结晶紫1g
95％乙醇溶液20mL
1％草酸铵水溶液1000mL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。
A2.5.2革兰氏碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300mL
将碘与碘化钾混合，加入蒸馏水少许，充分摇匀，待完全溶解，再加入蒸馏水至300mL。
A2.5.3脱色液
95％乙醇。
A2.5.4沙黄复染液
沙黄1g
95％乙醇2g
蒸馏水90mL
将沙黄溶于95％乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法
染色的基本步骤为：
1）涂片：
在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌的接种环取菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜；
2）干燥：
在室温中使自然干燥；
3）固定：
将涂片迅速通过火焰2～3次，以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为度；
4）染色：
滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗；
5）媒染：
滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
6）脱色：
滴加95％乙醇脱色，约30s，水洗；
7）复染：
滴加复染液，复染1min，水洗。
革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌染色后呈红色。
注：
亦可用1：
10稀释的石炭酸复红染色液作复染剂，复染时间为10s。
A3检验程序
样品处理：
确定样品接种量
发酵试验：
将样品接种于乳糖胆盐培养液
平板分离：
将产酸发酵管液接种于EMB
鉴定：
挑取可疑菌落革兰氏染色、镜检
挑取革兰氏阴性无芽孢杆菌接种于乳糖蛋白胨培养液
计数：
根据产酸产气的阳性管数查MPN表
检验结果报告
A4操作步骤
样品准备
A4.1.1污水
污水样品应至少取200mL，使用前应充分混匀。
根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确定污水样品接种量。
粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、。
粪大肠菌群数较多时接种量为1mL、、或、、等。
接种量少于1mL时，水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。
接种量为、时，取稀释比分别为1:
10、1:
100。
其它接种量的稀释比依此类推。
1:
10稀释样品的制作方法为：
吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:
10稀释样品。
因此，取1mL1:
10稀释样品，等于取污水样品。
其它稀释比的稀释样品同法制作。
注1：
若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
A4.1.2污泥
污泥样品应至少取200g，使用前应充分混匀。
根据预计的污泥样品中粪大肠菌群数量确定污泥样品接种量。
粪大肠菌群数量相对较少的污泥样品接种量一般为、、。
粪大肠菌群数量较多时接种量为、、或、、等。
污泥样品应制成稀释样品后供发酵试验使用。
接种量、、的稀释样品制作方法如下：
取20g污泥样品，加入到三角烧瓶中，加灭菌水使成200mL，混匀，制成1:
吸取1:
10稀释样品1mL，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:
100稀释样品。
按同法制成1:
1000稀释样品。
接种1mL1:
100、1:
1000稀释样品等于接种、、污泥样品。
若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
发酵试验
将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管（内有小倒管）中，44℃培养24h。
样品接种体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定：
样品为污水时，取三个接种量、每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。
试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。
若接种量为10mL，吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内；
若接种量为1mL时，吸取1mL样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；
若接种量少于1mL时，吸取1mL稀释样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。
样品为污泥时，取三个接种量、每个接种量的稀释样品分别接种于3个试管内，共需9个试管。
9个试管中，各装有10mL乳糖胆盐培养液。
各个试管接种稀释样品体积均为1mL。
平板分离
大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色、产气时小倒管内出现气泡。
经24h培养后，将产酸的试管内培养液分别划线接种于EMB培养基上。
置于37℃培养箱中，培养18～24h。
鉴定
挑选可疑粪大肠菌群菌落，进行革兰氏染色和镜检。
可疑菌落有：
1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
2）紫黑色，不带或略带金屑光泽的菌落；
3）淡紫红色，中心色较深的菌落。
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取上述典型菌落1～3个接种于盛有5mL乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内，置于44℃培养箱中培养24h。
产酸产气试管为粪大肠菌群阳性管。
A5计数
根据证实有粪大肠菌群存在的阳性管数，查表A1或A2可得100mL污水或1g污泥中粪大肠菌群MPN值。
由于表A1和表A2是按一定的三个10倍浓度差接种量设计的（污水接种量为10mL、1mL和，污泥接种量为、和），当采用其他三个10倍浓度差接种量时，需要修正表内MPN值，具体方法如下：
表内所列污水（污泥）最大接种量增加10倍时表内MPN值相应降低10倍；
污水（污泥）最大接种量减少10倍时表内MPN值相应增加10倍。
如污水接种量改为1mL、和时，A1表内MPN值相应增加10倍。
其它的三个10倍浓度差接种量的MPN值相应类推。
由于A1表内MPN值的单位为每100mL污水样品中MPN值，而污水以1L为报告单位，因此需将查A1表得到的MPN值乘上10，换算成1L污水样品中的MPN值。
表A1污水中粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表
（污水样品接种量为5份10mL水样，5份1mL水样和5份水样）
阳性管数
100ML水样中MPN
阳性管数
接种100ML
水样
接种10ML
接种水样
2
5
4
13
1
7
17
9
21
3
12
25
14
30
16
36
6
26
31
11
19
42
22
32
38
44
50
27
33
39
20
45
52
15
59
8
34
40
47
23
54
62
28
69
41
48
56
64
29
72
81
43
58
10
76
95
46
63
84
110
130
49
70
94
24
120
150
180
79
140
210
250
170
220
280
350
430
240
540
37
920
1600
>
表A2污泥中粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表
（污泥样品接种量为3份泥样，3份泥样和3份泥样）
每1g泥样中MPN
阳性管数
接种污泥管
75
160
93
290
460
1100
35
53
A6检验结果报告
根据粪大肠菌群MPN值，报告1L污水或1g污泥样品中粪大肠菌群MPN值。
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