8蛋白质的生物合成和基因工程文档格式.docx
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不作起始密码时，也就是处于中间时，AUG对应的是Met，GUG对应Val。
终止密码：
UAA、UAG、UGA，它们是空密码，不对应任何AA。
易记密码：
AAA：
Lys
GGG：
Gly
CCC：
Pro
UUU：
Phe
2.密码子的主要性质
简并性：
1种AA可以有几个密码子，但一个密码子只能决定一种AA，例如：
Leu：
CUA/CUG/CUC/CUU，其意义是减少突变的影响。
这样根据mRNA（或基因）的碱基序就能决定唯一的一条多肽链，反过来就不可以。
密码子中间的一个碱基通常决定了AA的性质：
嘧啶-疏水AA；
嘌啉-亲水AA；
记作苏蜜一号西瓜。
通用性与例外：
一切生物包括真核、原核、病毒都使用同样的遗传密码，只有线粒体例外，如果细胞核产生的mRNA进入到线粒体中，将合成出怪异的蛋白质。
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不重叠、不跳跃：
从起始密码AUG开始，一直都以三联体连续阅读，中间不重叠、不跳跃，见P497，这叫开放的阅读框架。
3.密码子和反密码子之间的作用-摆动学说
反密码子是tRNA的反密码环上的特定三联体，见P148tRNA的三叶草模型。
请注意反密码子与密码子的配对也要反向平行。
密码子和反密码子之间的作用遵循Creck提出的摆动学说
原则上要求碱基配对：
例如密码子AGC就要与反密码子GCT配对：
密码子（mRNA）5’-AGC-3’
反密码子（tRNA）3’-TCG-5’
密码子的前两个碱基要求与反密码子严格配对，最后一个碱基可以不严格配对。
摆动学说的意义：
便于mRNA与tRNA分离。
2.参与蛋白合成的重要物质
一.核糖体：
是蛋白质合成的场所
1.组成：
rRNA原核5S、16S、23S三种
真核5S、5.8S、18S、28S四种
蛋白质多种
2.形态
亚基：
大亚基原核50S
真核60S
小亚基原核30S
真核40S
单核糖体：
1个大亚基+1个小亚基，原核70S（50+30），真核80S（60+40），S不能简单的相加。
见P503或讲义P49草图
多聚核糖体：
由一条mRNA串起来的多个核糖体，见P509或讲义P49草图。
3.功能
结合mRNA：
夹在大亚基和小亚基之间，见P504或讲义P49草图。
结合氨酰tRNA、肽酰tRNA：
在大亚基上，见讲义P49草图。
A位：
结合氨酰tRNA的部位，Amino…，第一个氨酰tRNA例外。
P位：
结合肽酰tRNA的部位，Peptide…，fMet-tRNAfMet例外。
E位：
结合空载tRNA，Exit
形成肽键：
由肽酰转移酶作用，最新的发现表明此酶由rRNA（原核23S）来充当。
二.成熟的mRNA
1.原核生物的成熟的mRNA特点：
没有5’端帽子和3’端尾巴，但有SD序列，即夹在5’端点和起始密码之间的一段不翻译序列，富含嘌啉，这是保证原核生物翻译正确起始的结构，SD序列可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，决定翻译的正确起始。
故在基因工程中要加上SD序列。
2.真核生物的成熟的mRNA特点：
有5’端帽子和3’端尾巴，但没有SD序列，正确的起始靠5’端帽子。
三.AA、tRNA、氨酰tRNA合成酶
基本AA只有20种，而tRNA的种类多得多，所以tRNA也有简并性，即一种AA可以被几种tRNA来运载。
氨酰tRNA合成酶的专一性很强，它能准确的辨认某种AA与带有该反密码子的tRNA，并在两者之间形成酯键，形成的部位是，AA的羧基与tRNA的3’端的CCA-OH，反应式为
氨酰tRNA合成酶
AA+tRNA------------------------→AA-tRNA
ATP↓AMP+PPi
消耗2分子ATP。
原核生物起始时的fMet-tRNAfMet与中间的Met-tRNAMet是由同一种酶催化的。
四.其它因子
起始因子：
IF，InitiationFactor
延伸因子：
EF，ElongationFactor
终止因子：
RF，ReleaseFactor
3.蛋白质合成的过程
AA的活化、起始、延伸、终止、肽链后加工
一.AA的活化
形成氨酰tRNA，见氨酰tRNA合成酶的反应式，20种基本AA都需要活化。
特殊情况：
原核生物起始密码AUG对应的AA活化形式是fMet-tRNAfMet
二.翻译的起始
1.正确的起始机制：
识别起始密码AUG，AGCUAUGAAUGGGAUG……GUAGGAAC？
原核生物靠5’端的SD序列，可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，其后第一个AUG就是起始密码。
真核生物靠的是5’端帽子结构，帽子后面的第一个AUG就是起始密码。
2.原核生物起始的过程：
在IF的作用下，核糖体、mRNA、fMet-tRNAfMet形成70S的三元复合物，见P504，其中，mRNA夹在核糖体的大小亚基之间，fMet-tRNAfMet位于大亚基的P位上而不是A位（核糖体误将fMet当作肽），tRNAfMet上的反密码子与mRNA上的起始密码AUG相结合。
见P504，这一过程要消耗1个ATP。
三.肽链的延伸
1.进位：
在EF作用下，由GTP供能，第二个AA-tRNA进入核糖体大亚基的A位，见P505
2.转肽（形成肽键）：
在肽酰转移酶（23SrRNA）的作用下，将“假肽酰”fMet从tRNAfMet身上转到第二个AA-tRNA的AA的氨基上，形成肽键，得到二肽酰tRNA：
fMet-AA-tRNA，以及空载的tRNAfMet，见P506，此步不需要能量。
3.移位：
在移位酶的作用下，由GTP供能，核糖体沿着mRNA的5’→3’移动一个三联体密码的距离，使空载的tRNAfMet进入E位，准备退出；
肽酰tRNA进入P位；
第三个AA-tRNA进入A位。
见P507
4.反复进行1.2.3.步，肽链沿着N→C方向延伸。
四.翻译的终止
1.当肽链延伸到终止密码时，因为它是空密码，没有任何tRNA与之对应，故A位空出，RF进入A位，使肽酰转移酶变为水解酶，释放出肽链和tRNA。
2.生物体为了加强终止，通常设置了两个以上并排的终止密码。
所以要合成含n个AA残基的肽链，mRNA至少含有3n+6个核苷酸。
五.肽链的后加工
1.端点的加工
原核生物N端去甲酰化、切除fMet。
真核生物N端切除Met。
N端甲酰化。
使得成熟蛋白质的N端多样化。
“凡是原核生物，蛋白质N端皆fMet”、“凡是真核生物，蛋白质N端皆Met”的说法是不对的。
C端氨酰化。
2.信号肽、导肽的切除
信号肽：
分泌蛋白和膜蛋白，其N端有一段疏水AA（约20～30个），保持着一级结构，能穿入或穿透细胞膜，就像针带线，当穿入或穿透细胞膜后就被水解掉。
导肽：
由细胞质合成的某些细胞器蛋白（如线粒体蛋白），其N端有一段碱性AA（约20～30个），能穿透细胞器的膜，也像针带线，当穿透细胞器的膜后就被水解掉。
3.蛋白质内含子的切除：
例如切除胰岛素原的C肽。
4.AA的修饰：
○P化（糖原磷酸化酶b的激活）、糖基化（糖蛋白）、OH化（羟脯氨酸）、GDP化（G蛋白）等
5.二硫键的形成，由此衍生出Cyss
6.与辅基相连：
如血红素
六.真核生物与原核生物蛋白质合成的比较
1.核糖体不同：
原核70S（50+30），真核80S（60+40）
2.起始AA不同：
原核是fMet，真核是Met。
3.起始机制不同：
原核SD序列，真核5’端帽子。
4.起始复合物的形成过程不同。
略。
5.真核生物过程更复杂，需要的因子更多。
七.蛋白质合成的抑制剂
原核绿霉素、红霉素、链霉素、四环素、新霉素、卡拉霉素
真核梭链孢酸、放线菌酮、蓖麻毒素、白喉毒素、干扰素（抗病毒）
原核与真核嘌啉霉素、
第十七章基因工程、基因表达、核酸测序
一.基因工程
上个世纪七十年代发展起来的一项新技术，将成为本世纪最具前途的工业。
把不同来源的基因按照设计蓝图重新整合成一个新的基因组（即DNA分子），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物，为人类服务。
它的意义在于，借用工程设计的思想，克服了生物种间限制，定向创造新的物种。
基因工程的一般步骤如下：
见讲义草图P72，整理如下
1.根据需要提出设计
2.分离带有所需基因的DNA片段
3.改造作为载体的DNA
4.把2、3体外重组
5.把重组的DNA分子引入受体细胞
6.分离这些纯系增殖细胞
7.使外来基因在受体细胞内表达
一.基因表达调控
基因表达：
基因如果进行了转录进而翻译，就叫基因表达，否则就叫基因不表达。
基因表不表达，什么时候表达，都受到严格的调控。
真核生物细胞的分化就是因为基因表达不同造成的。
基因表达的调控可以分为DNA水平（拓扑异构和启动子的结构）、转录水平（操纵子模型、基因重排）、翻译水平三种水平。
1.操纵子学说之一-------乳糖操纵子
提出者：
法国人，Jacob和Monod，诺贝尔奖金得主。
乳糖操纵子的现象：
E.coli中与乳糖利用有关的酶是半乳糖苷酶（LactZ）、透性酶（LactY）、转乙酰酶（LactX）三种，当培养基中不含有乳糖时，细胞基本上不产生这三种酶（5个/细胞），当培养基中加了乳糖时，细胞产生很多这三种酶（5000个/细胞）。
符合经济原则。
乳糖操纵子模型：
E.coli的DNA上有关乳糖操纵子的结构包括：
见讲义草图P55
调节基因I或R产生有活性的阻遏蛋白，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。
诱导物乳糖可以跟它结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。
控制元件启动子（P）：
RNA聚合酶的驻地
操纵基因（O）：
能被有活性的阻遏蛋白结合，阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。
结构基因Z：
产生半乳糖苷酶（LactZ）
Y：
产生透性酶（LactY）
X：
产生转乙酰酶（LactX）
乳糖操纵子模型的作用机理：
培养基中不含有乳糖时，调节基因产生的阻遏蛋白有活性，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。
培养基中加了乳糖时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。
2.操纵子学说之二-------组氨酸操纵子
现象：
当培养基中不含有His时，细胞产生很多的His合成酶。
当培养基中加了His时，细胞基本上不产生His合成酶。
也符合经济原则。
His操纵子模型：
它与乳糖操纵子模型不同的地方在于，调节基因产生的阻遏蛋白是没有活性的，它需要结合His后才具有活性，这里His不是诱导物而是辅阻遏物。
三.核酸测序
1.RNA的测序
一般过程：
目的RNA的分离提纯→3’,5’末端分析→目的RNA降解为2套小片段，并分离各片段→片段测序→拼凑
RNA的水解
碱水解：
高温稀氨水可以将RNA彻底水解，水解位置在…Np↓Np↓…，产物为3’-NMP。
酶水解：
酶类别底物特异性产物
磷酸单酯酶PMase外切酶DNA、RNA，见P141p↓N……N↓p端点有游离的-OH
牛胰核糖核酸酶RNaseⅠ内切酶RNA左边为Py，切点见P140-Pyp↓N-3’端Py核苷酸具有游离的3’-○P
CMCT保护的RNaseⅠ内切酶RNA左边为C，切点见-Cp↓N-3’端C核苷酸具有游离的3’-○P
核糖核酸酶T1RNaseT1内切酶RNA左边为G，切点见P140-Gp↓N-3’端G核苷酸具有游离的3’-○P
核糖核酸酶U2RNaseU2内切酶RNA左边为Pu，切点见P140-Pup↓N-3’端Pu核苷酸具有游离的3’-○P
RNA的末端分析，判断3’,5’末端核苷酸是什么。
5’末端分析：
先用PMase去掉RNA端点核苷酸的游离磷酸根，露出-OH，再用多核苷酸激酶和放射性同位素P32（简记为γ-P32）标记过的ATP，将RNA5’末端核苷酸的5’位上
接上γ-P32，这样就把5’端核苷酸标记了。
稀氨水彻底水解RNA，电泳，放射自显影，标准图谱，可知该核苷酸的种类。
3’末端分析：
操作同上，在电泳图谱上找出核苷的位置。
对照标准图谱，可知该核苷酸的种类。
RNA片段测序：
将这个RNA片段的5’端进行标记（见<
）
↓
4种RNA内切酶进行不同步的作用（解释:
每个分子的作用位点都不同）
电泳分离各产物
放射自显影
直读核酸序列
例如：
*AGCUAGCU…
5’-*多聚核苷酸长度RNaseⅠCMCT+RNaseⅠRNaseT1RNaseU2直读5’-
1*AA
2*AG*AGG
3*AGC*AGCC
4*AGCUU
5*AGCUAA
6*AGCUAG*AGCUAGG
7*AGCUAGC*AGCUAGCC
8*AGCUAGCUU
………………
思考题：
？
1*
2*
3**
4**
5**
6**
7*
8*
……………
2.DNA的测序
DNA测序的一般程序：
DNA限制性内切酶-----→DNA片段（2套）变性、电泳-----→DNA单链加减法、化学裂解法-----→片段定序片段重叠法-----→拼凑DNA序列
化学裂解法进行DNA单链片段定序
将这个DNA单链片段的5’端进行标记（同上）
用4种特异性化学试剂进行不同步断裂（解释）
直读DNA序列
4种特异性化学试剂：
断裂是通过破坏核苷酸来实现的。
硫酸二甲酯（DMS）：
断裂对象是G，…G…
甲酸：
断裂对象是嘌啉，A和G，…G…A…
肼：
断裂对象是嘧啶，C和T，…C…T…
NaCl+肼：
断裂对象是C，…C…
5’-*多聚脱氧核苷酸长度硫酸二甲酯（DMS）甲酸肼NaCl+肼直读5’-
0*A
1*A*AG
2*AG*AGC
3*AGCU
4*AGCUA
5*AGCUA*AGCUAG
6*AGCUAG*AGCUAGC
7*AGCUAGCU
0*
2**
6*
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