抗体芯片研究文档格式.docx

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随着人类基因组计划的基本完成,以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代到来了。

人们认识到，基因只是遗传信息的载体，基因水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化,而生命活动的执行者是基因的表达产物蛋白质。

为了揭示细胞内各种代谢过程与蛋白质之间的关系以及某些疾病发生的分子机理,必须对蛋白质的功能进行深入的研究。

因此,对生命的复杂活动全面和深入的认识,必然要在一定生理或病理条件下对蛋白质进行研究。

微型化、集成化、高通量化的抗体芯片将成为一个新兴的研究工具。

蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；

用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。

而抗体芯片（抗体微阵列）作为蛋白芯片的一种,具有微型化、集成化、高通量的特点,可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达丰度,目前主要用于信号转导、蛋白质组学、肿瘤及其他疾病的相关研究。

抗体芯片是依赖于抗体作为亲合体固定在固相载体的表面,通过特异性的免疫反应捕获待测样品中的抗原，从而实现高通量的免疫检测，可以一次性的检测上百上千种蛋白质的表达丰度。

抗体芯片具有特异性强，敏感性高，检测范围广等优势，已经应用在医学、生物学、药学等多个领域。

一、抗体芯片的基本原理

把能和不同抗原特异性结合的多种抗体高密度地固定到玻片或其他载体上,使待测样品通过芯片表面,经过洗脱把非特异性结合的蛋白洗掉,从而对特异性结合在上面的抗原进行检测。

它包括4大技术环节，①抗体芯片的制备、②样品的制备、③生物分子反应、④信号的检测及分析。

1、抗体芯片的制备：

将大量不同的抗体按特定顺序排列并固定在固体支持物上,且保留其抗原结合能力,制成抗体芯片膜,芯片上每个抗体都是并列双点,以增加结果的可靠性。

2、样品的制备：

将组织、细胞或体液中样品进行特定的生物处理,获取其中的蛋白质并加以标记,以提高检测的灵敏度。

3、生物分子反应：

芯片膜与蛋白质样品一起孵育,在孵育过程中根据抗体可特异识别和结合蛋白的特性,芯片膜识别并捕捉抗原,经过洗脱将未能与芯片上的抗体识别结合的成分洗去。

4、信号的检测及分析

利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的荧光强度,通过荧光强度分析测定各种蛋白的表达。

图1：

抗体芯片的四大技术环节

二、抗体芯片的操作流程

1、准备好相应的抗体芯片，将样品加到芯片上，孵育1小时。

2、加入生物素标记的抗体，共同孵育1小时。

3、加入HRP标记的链霉亲和素，共同孵育1小时。

4、经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度。

5、分析芯片数据。

6、得出结论。

图2：

抗体芯片的操作流程

图3：

抗体芯片反应模式图

三、抗体芯片的检测内容

1、蛋白表达谱：

可检测一种样品的蛋白表达谱,也可检测两种不同样品间蛋白表达水平的相对差异,一次实验可比较出数百种蛋白表达水平的变化。

这充分体现的抗体芯片高通量的特点。

2、磷酸化水平改变：

可从几百种已知蛋白中快速筛选磷酸化水平发生改变的蛋白。

目前市场上已经出现了一批专门用于测定磷酸化的抗体芯片。

研究蛋白质的磷酸化在信号转导中具有重要的意义。

3、蛋白质间相互作用：

用于检测某一种蛋白与芯片上各种蛋白之间是否存在相互作用。

图4：

抗体芯片的检测内容

抗体芯片具体的检测包括：

抗体检测、酶的分析、蛋白质-DNA互作、蛋白质-小分子互作、蛋白质-脂质互作、蛋白质-蛋白质互作。

四、抗体芯片的应用

抗体芯片技术的主要应用是发现蛋白质新的功能、了解蛋白功能的分子机制、分析特定刺激因素，激发的信号通路、筛选药物候选的效应分子和发现新的肿瘤生物标记物等，尤其是在疾病诊断方面显示出了强大的生命力。

1、抗体芯片在肿瘤等疾病诊断方面的应用

目前,抗体芯片在肿瘤中的应用主要是通过筛选及鉴定肿瘤标志物，进行肿瘤的早期诊断及治疗监测。

已有不少学者利用抗体芯片对各种肿瘤标志物进行检测，主要包括卵巢癌肿瘤标志物的检测、肝癌肿瘤标志物的检测、胰腺癌肿瘤标志物的检测、肺癌肿瘤标志物的检测、前列腺癌肿瘤标志物的筛选与鉴定、白血病CD抗原（免疫组型）的检测等等。

抗体芯片高通量、特异性、敏感性的特点在疾病诊断方面显示出了强大的优势。

物,进行肿瘤的早期诊断及治疗监测。

2、抗体芯片在蛋白质组学方面的应用

想对数以百万计的蛋白质进行分析，依靠以前的那种作坊式研究方法远远不能满足要求，必须发展一种快速高通量的蛋白质检测技术，由此蛋白质芯片也就应运而生了。

蛋白质组学研究主要有两条技术路线:

一、通过二维电泳及质谱分析。

二、通过抗体芯片进行研究尽管第一个抗体芯片用于诊断,但是抗体芯片的主要用途却是基础蛋白组学研究。

蛋白组的研究焦点在于靶蛋白的鉴定和发现,蛋白质的功能分析,细胞表达谱的鉴定。

3、抗体芯片信号转导研究中的应用

抗体芯片技术不仅能检测各种信号蛋白的表达,同时还能分析多种蛋白质与蛋白质间的相互作用,可从几百种已知蛋白中快速筛选磷酸化水平发生改变的蛋白,蛋白质磷酸化是翻译后加工的主要类型,涉及许多重要细胞功能的改变,是蛋白质活性改变的标志,在信号转导研究中有重要意义。

4、药物学研究及应用

抗体蛋白芯片在药物学方面的研究包括耐药菌的检测、药物靶点研究、药物代谢研究方面的广泛应用。

五、抗体芯片应用实例

1、利用EGFR磷酸化抗体芯片检测磷酸化位点

表皮生长因子受体EGFR磷酸化抗体芯片是将EGFR磷酸化特异性抗体印制在膜上。

将处理的和未处理的细胞裂解液和膜芯片一起孵育，洗膜后加入还有特殊磷酸化残基的生物素标记EGFR抗体，然后加入HRP-链霉亲和素孵育，最后膜芯片上的信号通过化学发光来显像。

图5：

利用抗体芯片检测A432细胞系中EGFR的活性

A431细胞系（人类表皮细胞的癌细胞系）记过无血清培养过夜，然后置于100ng/ml的表皮生长椅子保持37℃，20min。

对照细胞同样是无血清培养过夜，未经过表皮生长因子的刺激。

采用化学发光来显示信号结果。

图6：

蛋白印迹分析hEGF处理和未处理的A431细胞系的提取物。

这个分析中使用磷酸化的EGFR（Tyr845）和磷酸化的EGFR（Tyr1173）抗体

此抗体芯片的优点：

1、检测表皮生长因子受体EGFR家族的17个特殊位点的磷酸化。

2、减少做蛋白印迹的多余时间。

3、检测不同的处理、催化剂或者抑制剂的影响。

4、鉴定病程中的关键影响因子。

5、发现生物标志物。

2、细胞因子抗体芯片

RayBio

C-系列是一种膜介质、半定量抗体芯片。

此芯片中捕捉抗体点于消化纤维素膜上。

加入HRP-链霉亲和素于化学发光试剂，信号能够透过数字影像X神仙胶片观察到。

G-系列芯片捕捉抗体点在标准型号玻片上，通过激光荧光活基因微阵列扫描仪，检测芯片信号

图7：

抗体芯片膜介质质（左）与玻片介质（右）

3、凋亡因子抗体芯片

通过使用RayBio

人凋亡因子抗体芯片，研究者能够同时检测细胞裂解物中的43中凋亡相关蛋白的水平。

在此芯片中捕获抗体排列与膜或玻片的生物素标记抗体，最后HRP-链霉亲和素或荧光素-链霉亲和素用于检测芯片信号。

实验方法：

Jurkat细胞进过凋亡诱导物处理7h（10mM放射菌素D，2mM喜树碱，100mM放线菌酮，10mM地塞米松和100mMEtopiside）。

50mg处理与未处理的Jurkat细胞裂解液于人凋亡抗体芯片上孵育过夜，洗涤后，加入生物素标记的抗体检测凋亡相关蛋白，之后加入HRP标记的链霉亲和素孵育，信号通过化学发光法检测。

图8：

通过抗体芯片检测出的差异点

优点：

1、无需免疫沉淀或Westernblot实验。

2、超高灵敏度，重现性与特异性好。

3、膜和玻片的载体形式。

4、检测结果可靠，适用于广泛的细胞系。

5、无需特殊仪器。

4、生物素标记的抗体芯片

生物素标记样品、透析后与芯片一起孵育。

这是一个简单的过程。

这个过程包括生物素标记样品中蛋白的主要氨基酸。

然后生物素标记的样品加入到膜芯片或者玻璃芯片上，室温孵育。

最后与HRP-链霉亲和素孵育，用化学发光或者荧光来显色信号。

图9：

生物素标记样品及分析过程

5、抗体芯片检测经过视黄酸诱导后F9小鼠的干细胞

图10：

抗体芯片检测经过视黄酸诱导后F9小鼠的干细胞

6、抗体芯片检测不同组织的蛋白表达差异

图11：

抗体芯片检测不同组织的蛋白表达差异

7、利用抗体芯片检测系统性红斑狼疮的自身抗体

系统性红斑狼疮（SLE）是一个常见的自身免疫疾病，可影响到身体任何部位。

严重危害人类健康。

蛋白质芯片技术已成为一种新的高通量的技术。

可以消耗很少的样品检测低风度的蛋白。

在许多疾病中，蛋白质芯片被用来检测自身抗体，包括自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、乳腺癌、卵巢癌和肌肉传染性疾病。

本实验利用抗体芯片技术来检测SLE中的自身抗体。

实验：

以SLE病人的血清为实验组，健康人的血清为对照组各30例。

利用抗体芯片检测其血清，将30例SLE和30例健康人的血清1:

500稀释，分别用芯片检测。

加入标记Cy5的抗人IgG抗体，扫描获得图片。

图12：

抗体芯片检测系统性红斑狼疮的自身抗体

对血清中的抗体进行进一步的检测：

实验采用两种方法，ELISA与Westernblotting

ELISA方法：

包被CLIC2蛋白→封闭→血清孵育（1:

100稀释）→洗板→HRP标记的鼠抗人IgG孵育→洗板→显色。

Westrenblotting方法：

CLIC2蛋白跑SDS-PAGE→转膜→封闭→血清（1:

200稀释）→洗膜→HRP标记的鼠抗人IgG孵育→洗膜→发光

两种方法结果相同。

六、抗体芯片的优缺点

1、简单的阵列技术能够并行的检测数百种反应，应用蛋白质芯片在各式各样的生物学研究中很有意义。

2、特异性高、亲和力强，灵敏性高、检测范围广、实用性强。

3、能够快速高通量定量分析大量的蛋白样品。

4、蛋白质芯片使用相对简单,结果正确率较高。

5、相对传统的酶标ELISA分析，蛋白质芯片采用光敏染料标记，灵敏度高、准确性好。

6、蛋白质芯片的所需试剂少，产品化后价格低廉。

7、需要的样品体积小,在样品有限的情况下尤其重要。

缺点：

1、难以获得大量多样性的抗体分子。

2、保护抗体不变性是抗体芯片一个重要参数,在点样或者后来与靶蛋白孵育的过程中的水分蒸发可以导致抗体变性。

3、前期费用高，特别是抗体多的芯片其费用较昂贵难以获取。

4、抗体芯片仍然没有一个量化的、标准化的程序来进行数据分析。

5、虽然抗原和抗体的结合具有高特异性,但由于蛋白的复杂性,仍存在特异性问题。

6、抗体芯片技术检测的结果是目的蛋白的相对丰度。

抗体芯片数据的正确使用和解释需要有一个合适的标准,这方面尚无系统研究。

七、抗体芯片发展前景与展望

在以研究蛋白质功能为主的蛋白组学时代,大规模、高通量对蛋白质进行研究成为主流,抗体芯片成为与二维凝胶电泳平行的蛋白质分析手段。

目前抗体芯片处于发展早期阶段,而且商业化抗体芯片基本都是用于肿瘤标志物的检测及相关疾病的诊断。

在植物蛋白的检测与蛋白质组学研究中少有商业化的抗体芯片，但是随着噬菌体抗体库技术、抗体芯片支持介质的改进、检测灵敏度和芯片稳定性的提高,抗体芯片必然在基础蛋白质组学研究、临床应用、疾病诊断等方面中发挥越来越重要的作用。

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