植物生理指标检测方法Word文件下载.docx
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3
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5
100μg/mL葡萄糖溶液(mL)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(mL)
蒽酮试剂(mL)
5.0
葡萄糖量(μg)
20
40
60
80
100
将各管快速摇动混匀后,在沸水浴中煮10min,取出冷却,在620nm波长下,用空白调零测定光密度,以光密度为纵坐标,含葡萄糖量(μg)为横坐标绘制标准曲线。
3.样品测定取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL,同以上操作显色测定光密度。
重复3次。
四、结果计算
溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×
提取液体积(ml)×
稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×
样品重量(g)×
106]×
式中:
C——从标准曲线查得葡萄糖量,μg。
VT——样品提取液总体积,mL。
V1——显色时取样品液量,mL。
W——样品重(g)。
植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。
因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
本实验将分别介绍这两种方法。
1.考马斯亮蓝法
一、实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内(0-100μg/mL),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。
二、实验材料、仪器和试剂
1.材料
小麦叶片或其他植物组织
2.仪器设备
分光光度计,离心机,研钵,25mL容量瓶1个,刻度吸管0.5mL2支,2mL1支,10mL试管3支。
3.试剂
(1)牛血清白蛋白配成1000μg/mL和100μg/mL。
(2)考马斯亮蓝G-250:
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100mL,最后用蒸馏水定容至1000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
(3)90%乙醇
(4)磷酸(85%,W/V)
三、实验步骤:
1.可溶性蛋白的提取
称取新鲜植物叶片0.5g置于研钵中,加入5mL4oC下预冷的浓度为50mmol/L,pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入10mL离心管中,在4oC冰箱中静置10min,于15000rpm/min下冷冻离心25min,上清液即为过氧化物粗提液。
4oC下保存备用。
2.标准曲线的绘制
(1)0-100μg/mL标准曲线的制作
取6支试管,按下表数据配制0-100μg/mL血清白蛋白液各1mL。
准确吸取所配各管溶液0.1mL,分别放入10mL具塞试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。
配制0-100μg/mL血清白蛋白液
6
100μg/mL牛血清蛋白量(mL)
蒸馏水量(mL)
蛋白质含量(mg)
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
(2)0-1000μg/mL标准曲线的制作
另取6支试管,按表10-2数据配制0-1000μg/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。
与步骤
(1)操作相同,绘出0-1000μg/mL的标准曲线。
配制0-1000μg/mL血清蛋白血液
7
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10
11
12
1000μg/mL牛血清白蛋白(mL)
3.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液0.1mL(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后在595nm下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。
四、
结果计算与分析
样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=
式中C-查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);
V-提取液总体积(mL);
a-测定所取提取液体积(mL);
W-取样量(g)。
叶绿素测定方法
1、称取剪碎叶片0.2g,放入容量瓶。
2、加50ml95%的乙醇。
3、遮光浸提48-72小时,中间摇晃一次。
(保证各批次浸提时间一致)
4、分光光度计测吸光值,三波长(649,665,470),分别对应叶绿素a、b和其他。
空白为95%乙醇。
计算公式如下:
CA=13.95*D665-6.88*D649
C单位:
mg/L
叶绿素a=CA*0.05/2
叶绿素单位:
mg/g
CB=24.96*D649-7.32*D665
叶绿素b=CB*0.05/2
C其他=(1000*D470-2.05*CA-114.8CB)/245
叶绿素其他=C其他*0.05/2
总叶绿素含量为三者之和。
一般叶绿素a/b为3:
1至4:
选择的波长不一样,计算公式就不一样,网上也有其他的波长方法,计算公式里的系数响应也有差异。
淀粉含量的测定
原理
淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖,在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖,测定葡萄糖含量,根据葡萄糖含量换算成淀粉含量
(C6H12O6)n→(C6H10O5)n+nH2O
糖在硫酸作用下生成糠醛,糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物,颜色的深浅与糖含量有关。
在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。
由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化,故必须在反应后立即在同一时间内比色
仪器用具和试剂
1.仪器用具:
移液枪、10ml离心管、试管、50ml容量瓶、试管架、棕色瓶(>
=500ml)、螺口瓶(>
=500ml)、烧杯、移液管(连续加样器)、离心机、分光光度计;
2.试剂:
葡萄糖标准液Ⅰ:
精确称取0.1000g蔗糖(分析纯),于小烧杯中加水溶解,定容至100ml,加2-3滴浓H2S04,该溶液可长期保存;
葡萄糖标准液Ⅱ:
准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml,加水定容量50ml,得到浓度为0.1mg/ml蔗糖标准液;
蒽酮溶液:
100mg蒽酮溶于50ml浓H2S04(化学纯)中,避光保存,当天配制当天使用;
3mol/LNaOH溶液:
12g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水;
3mol/LHcl溶液:
25ml浓盐酸与75ml蒸馏水混匀。
测定方法
1.植物淀粉相关溶液的提取:
向测可溶性糖所剩残渣中加入7ml3mol/L的盐酸,在沸水浴中煮沸45分钟,取出冷却,4000转/分离心15分钟,取上清到50ml容量瓶中,加入7ml3mol/LNaOH,用蒸馏水定容到50ml,作为待测样品。
2.标准曲线的配制:
吸取0.1mg/ml葡萄糖标准液按下表加入至11支试管:
0.1mg/ml葡糖(ml)
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
蒸馏水(ml)
葡糖浓度(mg/ml)
0.01
0.03
0.05
0.07
0.09
蒽酮试剂(ml)
8.0
4.0
45℃水浴中显色10~15分钟,625nm处测OD值
3.准确吸取待测液1.0ml,加蒽酮4.0ml,在45℃水浴中显色10-15分钟,各管在加入蒽酮试剂时要迅速,加完后用力振荡混匀。
4.取出后避光冷却,在625nm处测OD值,从标准曲线上得到提取液中可溶性总糖含量。
结果计算
葡萄糖糖含量(%)=标准曲线对应含糖量×
定容体积×
100/(样品质量×
显色吸取液体积×
103)
粗淀粉含量(%)=葡萄糖含量×
强酸溶液,注意安全
超氧化物歧化酶(SOD)的测定
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧自由基O2·
ˉ,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2·
ˉ,从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性的大小。
二、实验材料、仪器和试剂:
高速离心机;
分光分度计;
微量进样器;
荧光灯(反应试管处理度为4000Lx);
试管或指形管数支。
(1)1.50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。
(2)2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:
称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL。
(3)3.750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:
称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL,避光保存。
(4)4.100μmol/LEDTA-Na2溶液:
称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。
(5)5.20μmol/L核黄素溶液:
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL避光存。
1.显色反应
取5mL指形管数支,测定管数目依据处理而定,另4支为对照管,按表2依次加入下列各溶液对照管用缓冲液代替酶液,蒸馏水0.25mL。
将其中2支对照管置于暗处,其它置于4000Lx日光下反应20min左右,主要看颜色的变化,全部变成灰色,对照可能较浅。
2.测定
待反应结束,以不照光的对照管做空白,依次测定其它各管的吸光值。
表2各溶液显色反应用量
试剂(酶)
用量(mL)
终浓度(比色时)
0.05mol/L磷酸缓冲液
1.5
130mmol/LMet溶液
0.3
13mmol/L
750μmol/LNBT溶液
75μmol/L
100μmol/LEDTA–Na2液
10μmol/L
20μmol/L核黄素
2.0μmol/L
酶液/缓冲液(对照)
0.1
对照管以缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.2
总体积
3.0
四、结果计算与分析
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。
SOD总活性
SOD比活力
SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。
比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
Ack—照光对照管的吸光度。
AE—样品管的吸光度。
VT—样品液总体积,mL。
Vt—测定时样品用量,mL。
W—样品鲜重,g。
蛋白质含量单位为mg/g。
五、注意事项
1.配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用,以防止Met活性损失。
2.配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶,并在4℃冰箱中保存备用,以防止NBT见光分解。
3.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。
六、思考题
1.在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管?
2.影响本实验准确性的因素是什么?
应如何克服?
实验六植物抗氧化酶活性的测定
酶液的提取
1.过氧化氢酶(CAT)的活性测定
植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而导致H2O2累积。
H2O2可以直接或间接地氧化细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除植物体内的H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此,植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
H2O2在240nm波长下有强吸收,过氧化氢酶(Catalase,CAT,EC1.11.1.6)能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
紫外分光光度计,离心机,研钵,25mL容量瓶1个,刻度吸管0.5mL2支,2mL1支,10mL试管3支,恒温水浴锅。
(1)0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮)。
(2)0.1mol/LH2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。
取10mL试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管(将酶液煮死),按表1顺序加入试剂。
表1紫外吸收待测样品测定液配制表
S0
S1
S2
粗酶液(mL)
pH7.8磷酸缓冲液(mL)
1.5
蒸馏水(mL)
25oC预热后,逐管加入0.3mL0.1mol/L的H2O2,每加完1管立即计时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔lmin读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,计算酶活性。
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(µ
)。
过氧化氢酶活性
ΔA240——AS0–(AS1+AS2)/2。
AS0——加入煮死酶液的对照管吸光度。
AS1、AS2——样品管吸光度。
Vt——粗酶提取液总体积(mL)。
V1——测定用粗酶液体积(mL)。
FW——样品鲜重(g)。
0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位(µ
t——加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
注意:
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
1.试剂中的H2O2的浓度对测定结果影响较大,要注意标定的准确性。
2.缓冲液中必须加PVP,以防止酶活性降低。
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2.超氧化物歧化酶(SOD)的测定
七、实验原理
八、实验材料、仪器和试剂:
(6)1.50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。
(7)2.130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:
(8)3.750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:
(9)4.100μmol/LEDTA-Na2溶液:
(10)5.20μmol/L核黄素溶液:
九、实验步骤:
3.显色反应
4.测定
3
0.6
酶液
0.5
6.0
一十、结果计算与分析
一十一、注意事项
4.配好的Met溶液须在4℃冰箱中保存备用,以防止Met活性损失。
5.配好的NBT溶液须放入棕色试剂瓶,并在4℃冰箱中保存备用,以防止NBT见光分解。
6.配好的核黄素溶液须放入棕色试剂瓶避光保存。
一十二、思考题
3.在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管?
4.影响本实验准确性的因素是什么?
3.过氧化物酶(POD)活性的测定
过氧化物酶(peroxidases,POD,EC1.11.1.7)是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等有密切关系,当植物受到环境胁迫时,酶活性就会发生变化。
在过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在470nm处有最大吸收,可用分光光度计测量470nm的吸光度变化,测定过氧化物酶活性。
分光光度计,研钵,100mL容量瓶,吸管,离心机。
(1)50mmol/L磷酸缓冲液pH7.0。
(2)过氧化氢:
取30%的