利用16SrRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定Word格式文档下载.docx

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通过比较生物大分子序列〔核苷酸或氨基酸序列〕差异的数值构建的系统树称为分子系统树。

系统树分有根树和无根树两种形式。

无根树只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反映进化途径。

而有根树不仅反映生物类群之间的系统发育关系，而且反映出它们有共同的起源及进化方向。

分子系统树是在进行序列测定获得分子序列信息后，运用适当的软件由计算机根据各微生物分子序列的相似性或进化距离来构建的。

计算分析系统发育相关性和构建系统树时，可以采用不同的方法如基于距离的方法[UPGMA、ME〔MinimumEvolution，最小进化法〕]、NJ〔Neighbor-Jioning，邻接法〕、MP〔MaximumParsimony，最大简约法〕、ML〔MaximumLikelihood，最大似然法〕和贝叶斯〔Bayesian〕推断等方法。

构建进化树需要做Bootstrap检验，一般Bootstrap值大于70，认为构建的进化树较为可靠。

如果Bootstrap值过低，所构建的进化树的拓扑结构可能存在问题，进化树不可靠。

一般采用两种不同方法构建进化树，如果所得进化树相似，说明结果较为可靠。

常用构建进化树的软件有Phylip、Mega、PauP、T-REX等。

本实验以枯草芽孢杆菌的鉴定为例，应用16SrRNA基因序列分析技术进行微生物鉴定的实验。

【实验用品与仪器】

1．菌种和质粒

〔1〕菌种：

枯草芽孢杆菌，E.coliDH5

〔2〕质粒：

pMD18-T载体

2．培养基

LB培养基：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1L，pH7.2。

3．试剂和溶液

琼脂糖、细菌基因组提取试剂盒、dNTP、DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、X-gal、IPTG、限制性内切酶SpHI和PstI等。

4．仪器设备及其他

PCR仪、电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、超净工作台、摇床、电子天平、恒温培养箱等。

【实验内容】

1．设计合成引物

使用16SrRNA全长通用引物。

引物1：

5′-AGAGGTTGATCCTGGCTCAG-3′；

引物2：

5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

提交基因合成公司合成。

2．PCR扩增16SrRNA基因片段

~ng，过多可能引发非特异性扩增，过少可能扩增失败PCR体系一般用25μL，使用保真度较高的DNA聚合酶。

反响体系：

模板1μL

引物10.5μL

引物20.5μL

dNTP（10mM）0.5μL

Taq酶〔5U/ml〕0.5μL

10×

PCRbuffer2.5μL

灭菌水至25μL

PCR反响：

94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环。

72℃10min。

4℃存放。

3．琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

配制1%琼脂糖凝胶，取4μLμLl6×

上样缓冲液加样，DL2000Marker作为分子量标准，在1×

TAEk，110V电泳45~60min，EB染色，紫外凝胶成像仪中观察。

16SrRNA基因片段大约为1.5kb。

4．胶回收16SrRNA基因片段

〔1〕电泳

配制1%低熔点琼脂糖凝胶，将PCR获得的16SrRNA基因与上样缓冲液混合，参加到一大的胶孔中。

4℃，50V恒压电泳2~3h。

〔2〕切胶

紫外灯下，用无菌刀片切下条带转移至干净的1.5mL离心管中。

〔3〕胶回收

1〕准确称量凝胶的重量，按1g≈1mL计，参加5倍体积的TE缓冲液，盖上盖子，于65℃保温5min融化凝胶。

2〕待凝胶冷却至室温，参加等体积的Tris饱和酚〔pH8.0〕，剧烈振荡混匀20s。

20℃，10000r/min离心10min，回收水相。

3〕参加等体积的酚：

氯仿的Tris饱和酚与氯仿等体积混合〕，剧烈振荡，20℃，10000r/min离心10min，回收水相。

4〕用等体积的氯仿抽提上清，颠倒混匀，20℃，10000r/min离心10min，回收水相。

5〕将水相移到一新的1.5mL离心管，参加0.2倍体积的10mol/l乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后在室温下放置20min。

然后于4℃，12000r/min离心10min，弃上清，找开管盖，晾干沉淀，将沉淀溶解在一定量的无菌双蒸水中备用。

5．16SrRNA基因片段通过pMD18-T载体进行克隆

〔1〕16SrRNA基因片段与pMD18-T载体连接

在0.5mL的微量离心管中分别参加以下溶液，16℃连接过夜〔12~14h〕。

pMD18-T载体100ng

胶回收的16SrRNA基因50ng

T4DNA连接酶1μL

2×

连接缓冲液5μL

无菌双蒸水至10μL

〔2〕转化

将连接好的载体在冰上放置5min，然后全部参加到装有200μLE.coliDH5a感受态细胞的微量离心管中，用预冷的移液枪头轻轻混匀，置于冰上5min。

然后在42℃水浴热击90s，迅速将离心管转移到冰上，放置5min。

将转化细胞转移到10mL无菌试管中，参加1mL37℃预热的LB培养基，37℃，200r/min振荡培养1h。

〔3〕重组子的筛选

将上述培养液涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上，37℃恒温培养过夜，出现白色菌落一般是重组子。

〔4〕重组子的酶切鉴定

挑取几个白色菌落，分别接种到含有终浓度100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

用碱法提取转化子质粒。

用限制性内切酶SphI和PstI，37℃酶切2~3h。

将酶切产物加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察1.5kb左右的酶切条带，证明是正确的重组子。

6．16SrRNA基因的序列测定

将验证正确的重组子交给专业测序公司完成测序。

7．序列分析与系统发育树的构建

〔1〕相似序列的获取

用BLAST生物信息数据库搜索功能进行在线相似性搜索，选择几个分类地位的相似序列。

〔2〕多重序列比对分析

用ClustX软件对多个相似序列进行多重序列比对分析。

〔3〕构建系统发育树

利用Mega4软件构建系统发育树。

〔4〕系统发育关系分析

【实验结果与分析】

1．将PCR扩增的凝胶电泳结果扫描图打印出来，并对结果加以分析说明。

2．对重组子筛选平板上的菌落特征进行描述和分析。

3．对PCR产物进行测序所得的序列进行序列特征分析。

4．对基于16SrRNA基因的序列构建的系统发育树进行系统发育关系分析。

【思考题】

1．16SrRNA基因的序列有什么特征？

2．利用16SrRNA基因序列分析方法获得的鉴定结果与菌株的分类结果是否一致？

假设不一致，如何确定其准确的分类地位？

附录：

用Mega4构建系统发育树的过程

1.利用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）数据库搜索程序获得16SrRNA相似序列

登录到有BLAST效劳的网站，如美国国立生物技术信息中心NCBI〔:

//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi〕。

进入BLAST主页界面，选择nucleotideblast〔blastn〕，把要搜索的DNA序列以FASTA格式粘贴到Search栏，Database选项选择Others，点击BLAST，得到resultofBlast，选项中序列以FASTA格式保存。

>

gb|HQ185400.1|Stenotrophomonasmaltophiliastrain563316SribosomalRNAgene,partialsequenceLength=1540

Identities=1457/1464（99%）,Gaps=1/1464（0%）

Strand=Plus/Plus

Blastn结果中参数含义：

Score是指提交的序列和搜索出的序列之间的分值，越高说明越相似；

Expect〔E值〕是指比对的期望值，比对越好E值越小，一般在核酸的比对，E值小于1e-10，比对就算是很好，多数情况下为0；

Identities是指提交的序列和参比序列的相似性，如上所指序列为1464核苷酸中二者有1457个相同；

Gaps指的是对不上的碱基数目；

Strand为链的方向，Plus/Minus指的是提交的序列与参比序列是反向互补的，如果是Plus/Plus那么二者皆为正向。

2.利用ClustalX进行相似序列的多重比对

将检测序列和搜索保存的同源序列以FASTA格式编辑成为一个文本文件，导入ClustalX程序进行多重比对，在Alignment菜单中点击DoCompleteAlignment，保存自动生成的*.aln和*.dnd文档。

3.使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）软件构建系统发育树

〔1〕翻开MEG程序，如以下图。

〔2〕MEG只能翻开meg格式的文件，先将ClustalX输出的.aln文件转换为meg格式的文件。

点File：

ConverttoMEGAFormat…，翻开转换文件对话框〔如以下图〕。

〔3〕选择文件和转换文件对话框，选择.aln文件，点OK〔如以下图〕

〔4〕转换成meg文件后查看meg序列文件最后是否正常，假设存在clustal.*行，即可删除。

点存盘保存meg文件，meg文件会和aln文件保存在同一个目录〔如以下图〕。

〔5〕退出转换窗口，回到主窗口。

点击步骤1中的“Clickmetoactivateadatafile〞翻开转换后的meg文件，选择序列数据类型，点击OK〔如以下图〕。

〔6〕数据翻开后出现两个窗口，主窗口下面有序列文件名和类型。

另一为序列数据窗口，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标，可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。

〔7〕构建进化树的算法主要分为两类：

独立元素法〔discretecharactermethods〕和距离依靠法〔distancemethods〕。

所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的〔例如：

一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了〕。

而距离依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。

进化树枝条的长度代表着进化距离。

独立元素法包括最大简约性法〔MaximumParsimonymethods〕和最大可能性法〔MaximumLikelihoodmethods〕；

距离依靠法包括除权配对法〔UPGMAM〕和邻位相连法〔Neighbor-joining〕。

用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做Bootstrap验证的进化树分析，Bootstrap验证是对进化树进行统计验证的一种方法，可以作为进化树可靠性的一个度量。

各种算法虽然不同，但是操作方法根本一致。

进化树的构建是一个统计学问题。

我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。

过程如下：

1〕参数的设置：

phylogeny→bootstraptestofphylogeny→NeighborJoinin（NJ）

2〕系统进化树的测试，可以选择“Testofphylogeny〞用Bootstrap，也可以选择不进行测试。

重复次数（Replications）通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。

一般选择500或1000。

设定完成，点compute，开始计算。

3〕输出系统发育树：

程序产生一个树，该窗口中有两个属性页，一个是原始树，一个是bootstrap验证过的一致树。

树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。

结果如下：

〔8〕进化树的优化：

1〕利用该软件可得到不同树型，如以下图所示：

2〕显示建树的相关信息：

点击图标i。

3〕点击优化图标，可进行各项优化：

Tree栏中，可以进行树型选择：

rectangulartree/circletree/radiationtree。

每种树都可以进行长度，宽度或角度等的设定。

Branch可对树枝上的信息进行修改。

Lable可对树枝的名字进行修改。

Scale栏可标尺设置。

Cutoff栏可cutoffforconsensustree。

一般为50%。