青霉素生产原理 Microsoft Word 文档文档格式.docx
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二、【培养基】
种子培养基：
玉米浆，蔗糖，硫酸铵，碳酸钙，豆油，消沫剂；
pH6．2～6．5。
发酵培养基：
玉米浆，磷酸二氢钾，无水硫酸钠。
碳酸钙，硫酸锰，硫酸亚铁，消沫剂；
pH4．7～4．9。
三、【生产】
1、种罐
2、发酵罐
发酵培养基在5O吨发酵罐内经高温消毒后降温至25℃，分别进行种罐种子液接种，发酵罐前期发酵液接种，混合接种和发酵前期工艺优化实验，实验过程中主要控制参数：
温度25℃，罐压0．090～0．100MPa，搅拌转速130r-min-。
，空气流量和补料根据发酵过程中的参数变化进行控制。
3、参数测定和计算方法
【菌浓测定】取发酵液lOml于离心管中，离心（3000rmin_。
）5min，测得沉淀物在培养液中的体积比即为菌浓。
【发酵效价测定】
发酵液经滤纸和微孔滤膜过滤后进行HPLC测定，高效液相色谱仪为Agilent1100型；
色谱条件：
以HAc-NaAc缓冲液一乙腈（体积比80：
20）作流动相。
检测波长为254nm，流速1．2ml-min-。
进样量20l，柱温25℃，柱型DiamonsilC18（4．6mm×
250mm），采用外标法测定样品中的青霉素效价。
【发酵指数计算】发酵指数=发酵效价×
发酵液体积／发酵罐体积×
发酵周期
【发酵提炼的生产指数计算】发酵提炼的生产指数：
发酵指数×
提炼收率
四、【结果与讨论】
第一次pH自控时间影响最为明显，然后依次是起始补糖率、前期空气流量和苯乙酸补加时间。
最佳工艺条件为A2BlClD3，即起始补糖率为0．5％，苯乙酸补加时间为6h，第一次pH自控时间为6h，前期空气流量为0．7vvm。
按正交实验得到的最佳工艺条件实验5批，与原工艺条件对照，5批的平均生产指数升高了3．6％。
表明实验所确定的工艺条件为较优的工艺条件。
【结论】混合接入两种种源，其中种罐种子液的接种量为20％，60h左右的前期发酵液的接种量为10％，总接种量为30％；
优化发酵前期工艺，调整起始补糖率为0．5％，苯乙酸起始补加时间为6h，第一次pH自控时间为6h，前期空气流量为0．7vvm。
改进后的接种工艺大幅提高了生产指标，其中发酵指数提高了10．8％，提炼收率提高了0．4％，发酵提炼的生产指数提高了II．2％。
显著提高了青霉素的生产效益。
五、【青霉素生产菌种的选育】
目的:
为了获得比现有青霉素生产菌株985＃更高产的稳定菌株.方法是自然选育与紫外线诱变育种结合使用,经过初筛、复筛等一系列工作,结果筛选得到高产菌株989＃.经考察,989＃菌株是一个比985＃菌株更高产的稳定菌株,可用于青霉素发酵生产以提高发酵单位。
六、【pH控制】
发酵液中的pH值对微生物的生长及生成物合成影响很大,必须进行有效控制。
在发酵过程中,由于生化反应过程的特性,会使pH值逐渐降低,另外（NH4）2SO4也会作为生物质的合成氮源加入发酵液中。
为了维持适宜的值,需加入碱性物质加以调整,而一般是用NH3"
H2O来调节发酵液中的pH值,原因是NH"
H2O也可作为生物质的氮源物质。
同时,由于青霉素菌适宜于稍偏酸性的环境生长,如发酵液中出现偏碱性或中性,不宜于菌体生长和产物合成,菌体衰老也会加快,因此这种pH控制系统中应避免出现超调现象。
若产生了超调,即pH值大于设定值时,一般就得靠发酵过程的生化反应机理来自然降低pH值,整个调节速度就比较缓。
通常情况下避免超调的办法是采用高比例度的PID调节规律,但这样一来,遇干扰时（若补料时补入（NH4）2SO4,pH值下降）,调节过程虽不出现超调现象,但过渡过程时间较长。
在研究和设计该控制回路时,最好既保证系统不出现超调,又要有较快的过渡过程。
七、【发酵罐搅拌器的转速与青霉素产生菌生长代谢的关系】
根据青霉素的不同产生菌与不同生长代谢阶段对摄氧量的不同要求及搅拌器转速对溶氧浓度占据的主导地位，对青霉素发酵罐的传统搅拌器进行调速技术改造非常必要。
通过改造工程，使青霉素发酵工艺中搅拌器转速、通气量、溶氧浓度和罐压等工艺参数有机结合，促使产生菌的生长代谢条件达到最佳状态。
【搅拌器】
青霉素生产发酵工艺是产生菌在适合的培养性、PH值、温度、通气和搅拌等条件下进行生长与合成青霉素的代谢活动。
发酵工艺的持续时间与发酵液内氧的传递能力、营养物质的消耗程度、有毒性和有抑制性化合物的形成及菌种的物质特性有关。
其中通气和搅拌功能是对产生菌提供生长代谢活动的氧源，而搅拌器的功能则是在发酵液通气的条件下，将空气打碎成小气泡，使其均匀分布在发酵液的各个角落，增加气液接触的有效面积，使发酵液随搅拌叶转动形成涡流并提高其湍动程度，减少菌丝因缺氧而产生结团现象，使氧的传递面积增大，延长氧在发酵液中的停留时间，达到增加青霉素产量的目的。
【搅拌器转速对青霉素发酵工艺的影响】
发酵罐的罐压维持微正状态虽然可以避免负压时造成的染菌和延长氧在发酵液中的停留时间，但是还应当考虑到，如将罐压从微正状态提高时，既不利于产生菌代谢时废气的排除与氧在发酵液内的传递，又增加了设备的负载，同时提高了有害气体的溶解度。
在这种情况下，如果单一考虑增大空气流量来提高供氧浓度，将会加快发酵液水分蒸发，随之也会带走更多的挥发性有机酸等其他的中间产物，对产生菌的代谢十分有利。
同时，发酵液的黏度也会上升，还会影响液体的湍动程度和氧从气相传递到发酵液中的液膜阻力，使氧的传递阻力增大。
此外，发酵液粘度较大时，泡沫将剧增而稳定，且不易破裂，使气液接触的总面积降低。
因此，为了消除过多的泡沫就要耗用大量的消沫剂。
但是，消沫剂用量过多时，不但不能消除泡沫，反而引起泡沫调节失控，PH值波动，最终导致异常发酵，造成不可挽回的青霉素生产工艺损失。
由于空气在发酵液中滞留的时间有限，对溶氧浓度的影响也将远小于搅拌器转速的影响。
由此可见，在青霉素发酵工艺中，并不提倡一味地增大空气流量，而应当调整搅拌器的转速，以便满足不同产生菌及其在不同生长代谢阶段对溶氧的需求。
但是，如果搅拌器的转速过高，不仅溶氧浓度趋向饱和，并且浪费能源，还容易损伤菌体形态和产生过多的泡沫。
发酵工艺过程
2.1菌种介绍
青霉是产生青霉素的重要菌种。
广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。
目前已发现几百种，其中产黄青霉（Penicillumchrysogenum）、点青霉（Penicillumnototum）等都能大量产生青霉素。
青霉素的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。
此外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。
1981年报导，疠孢青霉是纤维素酶的新来源，它能分解棉花纤维。
2.2菌种的保藏
菌种的保藏方法有：
斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法。
斜面菌种低温保藏法
利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。
把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等，直接放入4～5℃冰箱中。
保藏时间一般不超过3个月，到时必须进行移接传代，再放回冰箱。
砂土管保藏法
将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。
若把砂土管放在低温或抽气后密封，效果更佳。
此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。
保藏期1～10年。
甘油封藏法
向培养好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。
该法既可防止培养基水分蒸发，又能使菌种与空气隔绝。
保藏期1～2年。
真空冷冻干燥法
是目前比较理想的一种方法。
在低于-15℃下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华致干。
在此环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5～10年，最多可达15年之久。
此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。
2.4种子制备
种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。
种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。
种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。
青霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。
2.5发酵培养基介绍
培养基是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。
培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。
青霉素的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部分组成。
碳源的主要作用是：
为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；
为合成目的产物提供所需的碳成分。
青霉素发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。
其中乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。
但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。
氮源的作用是供应菌体合成氨基酸和三肽的原料，以进一步合成青霉素。
主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。
玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因而利用率较高。
固体有机氮源原料一般需粉碎至200目以下的细度。
有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。
无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。
碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。
另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。
由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。
发酵时间愈长，则铁离子愈多。
铁离子在50µ
g/ml以上便会影响青霉素的合成。
采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素产量并无改进。
所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。
添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，添加苯氧乙酸则产生青霉素V。
因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。
但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。
也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。
而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。
前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中控制在50µ
g/ml左右。
由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。
采用植物油消沫仍旧是个好方法，一方面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作用，但现在已普遍采用合成消沫剂（如聚酯、聚醇类消沫剂）代替豆油。
2.6灭菌
“灭菌”指的是用化学或物理的方法杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。
灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。
工业上常用的方法有：
干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。
在青霉素的生产中，对培养基和发酵罐主要采用的是湿热蒸汽灭菌和空气过滤除菌的方法。
2.7发酵
这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。
发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。
接种量一般为5～20%。
发酵周期一般为4～5天，但也有少于24小时，或长达二周以上的。
在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。
2.7.1发酵的过程控制
1、碳源控制：
青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。
乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比较好的碳源，但必须控制其加入的浓度，因为葡萄糖易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而影响青霉素的合成，所以可以采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖。
苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素G的侧链前体。
菌体对前体的利用有两个途径：
直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。
前体究竟通过哪个途径被菌体利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。
通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取决于培养基的pH和前体的浓度。
碱性时，苯乙酰胺有毒；
酸性时，苯乙酸毒性较大；
中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。
前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。
所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。
在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速率随培养基pH上升而增加。
年幼的菌丝不氧化前体，而仅利用它来构成青霉素分子。
随着菌龄的增大，氧化能力逐渐增加。
培养基成分对前体的氧化程度有较大影响，合成培养基比复合培养基对前体的氧化量少。
为了尽量减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以保持前体的供应速率略大于生物合成的需要。
2、pH控制：
在青霉素发酵过程中，pH是通过下列手段控制的：
如pH过高，则添加糖、硫酸或无机氮源；
若pH过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。
另外，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液pH维持在6.8～7.2，以提高青霉素产量。
3、温度控制：
青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，因此生产上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要。
一般一级种子的培养温度控制在27±
1℃左右；
二级种子的培养温度控制在25±
发酵前期和中期的温度控制在26℃左右；
发酵后期的温度控制在24℃左右。
4、补料控制：
发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及pH外，补加氮源也可提高发酵单位。
经试验证实：
若在发酵60～70h开始分次补加硫酸铵，则在90h后菌丝含氮量几乎不下降，维持在6%～7%，，且60%～70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近30μl/（mg菌丝·
h），抗生素产率为最高水平的30%～40%；
而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为7%，以后逐级下降。
至发酵结束时为4%。
发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量为16μl/（mg菌丝·
h），且抗生素产量下降至零，总产量仅为试验罐的1/2。
因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。
5、铁离子的影响：
三价铁离子对青霉素生物合成有显著影响，一般若发酵液中铁离子含量超过30～40μg/ml，则发酵单位增长缓慢。
铁离子对产黄青霉绿色孢子合成青霉素的影响见下表。
因此铁罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使铁离子含量控制在30μg/ml以下。
2.7.2防止染菌的要点
染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。
影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。
请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。
2.7.3空气系统的要求
防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。
提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤着手。
防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。
2.7.4蒸汽系统的要求
重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在30～35千帕以上。
1、连续灭菌设备：
连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。
2、发酵罐：
发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。
凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。
3、无菌室：
用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。
第三章
提炼工艺过程
3.1发酵液预处理
发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。
如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。
对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。
如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。
如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。
Na5P3O10+Mg2+====MgNa3P3O10+2Na+
加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。
此外，两者还有协同作用。
他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。
2K4Fe（CN）6+3ZnSO4
K2Zn[Fe（CN）6]2
+2Na+
为了有效的去除发酵液中的蛋白质，需加入絮凝剂。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子化合物。
含有很多离子化基团（如—NH2，—COOH，—OH）。
3.2提取
化学提取和精制的目的：
从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。
由于发酵液中青霉素浓度很低，仅0.1～4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。
发酵液中常见的杂质有：
菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处理需要加入的杂质等。
在提炼过程中要遵循下面四个原则：
1、时间短
2、温度低
3、pH适中
4、勤清洗消毒
常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。
1、溶媒萃取法
这是利用抗生素在不同的pH值条件下以不同的化学状态（游离态、碱或盐）存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。
利用此原理就可借助于调节pH值得方法时抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。
所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。
2、离子交换法
利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。
3、沉淀法
是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法。
青霉素的提取采用溶媒萃取法。
青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。
利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。
选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。
工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。
萃取2－3次。
从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择2.8-3.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.2。
为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。
所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.8~3.0，加入醋酸丁酯。
在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。
第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。
3.3精制
这是青霉素生产的最后工序。
对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”的规定。
3.3.1脱色和去热原质
脱色和去热原质是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。
色素是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。
热原质是在生产过程中由于被污染后杂菌所产生的一种内毒素。
生产中一般用活性炭脱色去热原质，但需注意脱色时pH、温度、活性炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则影响收率。
3.3.2结晶
抗生素精制常用结晶法来制得高纯度成品。
常用的几种结晶方法有：
1、改变温度结晶
利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。
2、利用等电点结晶
当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。
3、加成盐剂结晶
在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。
青霉素钠盐在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性质，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋酸钠乙醇溶液，并控制温度青霉素钠盐就结晶析出。
反应如下：
醋酸丁酯中含水量过高会影响收率，但可提高晶体纯度。
水分在0.9%以下对收率影响较小。
得到的晶体要求颗粒均匀，有一定的细度。
颗粒太细会使过滤、洗涤困难。
晶体经丁醇洗涤，真空干燥即可等到成品。
3.4成品鉴定
成品鉴定是根据药典的要求逐项进行分析，
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