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因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因有效地转移到人体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是关系到基因治疗成败的关键。

经过近二十年的努力，各种帮助外源性基因进行转移的方法相继问世。

这些方法包含物理学、化学和生物学方法。

物理方法主要有电穿透法、显微注射法、基因枪法和碳化硅纤维介导法等；

化学方法主要包括磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖介导法、聚乙二醇介导法和脂质体介导法等；

生物学方法主要包括以病毒（如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和疱疹病毒等）为载体进行基因转移，以及农杆菌介导法等；

生物物理方法主要有电击法和胚胎干细胞法等。

在前述的各种转导方法中，除了电穿透法、显微注射法、基因枪法和碳化硅纤维介导法等物理方法，其他各种转导技术都是利用纳米级载体携带外源基因进入受体细胞，因此属于典型的纳米操作范畴。

随着基因治疗研究的不断深入，尤其是伴随着基因治疗临床实验的广泛开展，人们已认识到理想的基因载体应当具备如下特点：

①靶向特异性，且不被免疫系统识别；

②有利于基因高效转移和长期表达；

③高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；

④无毒副作用，可生物降解，对病人和环境安全无害。

目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viralvector）和非病毒载体（non-viralvector）两种。

基于本书为“纳米药物”，故本章重点阐述与纳米技术关系密切的非病毒载体。

非病毒纳米基因载体的研究在近几年愈来愈受到人们的重视。

到目前为止，研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒纳米基因载体，主要包括脂质体（liposomevector）和阳离子聚合物（cationicpolymervector），如壳聚糖、多聚赖氨酸、树状大分子等。

非病毒纳米基因载体的本质是将基因治疗中的基因看作药物，然后从药剂学和生物药剂学的角度来考虑如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。

由于常用的DNA为超螺旋或开环结构，空间体积太大，并且不能有效主动地进入细胞，因此必须进行压缩（condensation）或利用其它分子或技术的辅助。

DNA分子在加入诸如多价阳离子（Ca2+、Co3+、La3+等）、脂质体、阳离子聚合物、酒精或碱性蛋白后通过压缩过程可以组装成高度有序的结构，使体积缩小为原来的百分之一以下，从而可以有效地进入细胞并进行转染。

7.2纳米脂质体

纳米脂质体介导的基因转移有以下的优势：

纳米脂质体与细胞膜融合将目的基因导入细胞后即被降解，对细胞无毒副作用，可反复给药；

纳米脂质体与基因的复合容易，制备简单，重复性好，易于大量生产；

纳米脂质体不激活癌基因和免疫反应；

DNA或RNA与纳米脂质体复合后，不易被灭活或被核酸酶降解；

纳米脂质体携带的基因可转运至特定部位，操作简单快速，重复性好。

纳米脂质体介导的基因转移面临的主要问题是脂质体对靶细胞缺乏识别能力，基因透过细胞膜的能力较低，以及脂质体在血浆中的稳定性较差。

为了解决以上问题，研究人员根据需要对脂质体进行了适当的修饰来制备各种类型的纳米脂质体，如阳离子纳米脂质体、聚阳离子纳米脂质体、免疫纳米脂质体、融合纳米脂质体、pH敏感纳米脂质体和长循环纳米脂质体等[1-5]，其中有关阳离子纳米脂质体的研究最为广泛。

本节重点介绍阳离子纳米脂质体（cationicnano-liposome）。

7.2.1阳离子纳米脂质体的组成

1987年，Felgner等[6]首次将等量的氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA）和二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）制成小单层脂质体，即转染试剂Lipofectin。

实验结果表明此转染试剂可有效地用于DNA转染。

1989年将该转染试剂用于RNA的转染，发现其可高效转移RNA到人、鼠等多种动物细胞内。

这一发现大大促进了阳离子脂质体作为一类新型高效基因载体的广泛应用研究。

目前使用的阳离子纳米脂质体通常由一种阳离子脂质和一种中性辅助脂质在适当的条件下复合而成[7]。

阳离子脂质体转基因的效率与阳离子脂质的组成密切相关[8]。

下面将分别对一些常见的阳离子脂质、辅助脂质和脂质体的结构进行介绍。

1阳离子脂质

阳离子脂质分子在结构上由四个部分组成：

一个或多个阳离子头部（head）、连接链（spacer）、连接键（linkerbond）和疏水烃尾（hydrophobictail）。

阳离子脂质的头部大都包含胺类基团（除一种脂质含脒基外），从简单的氨基到被甲基或羟乙基团取代的季铵盐。

阳离子脂质的极性头起着脂质体与DNA、脂质体-DNA复合物与细胞膜或细胞内其它组分相互结合的作用。

在阳离子胆固醇衍生物中，带有叔胺基团的阳离子胆固醇化合物比季铵盐化合物有更高的转染活力，并且毒性小得多。

带有多价极性头基团或具有多个正电荷极性头的阳离子脂质体转染效率较高，这可能是因为它与DNA的结合较牢固。

连接链的长度能影响阳离子纳米脂质体与粘膜表面的相互作用，从而影响转染活力。

一般来说，带有长连接链的阳离子纳米脂质体能显著增强与粘膜表面的相互作用，转染效率高。

连接键是类脂分子很重要的组成部分，它决定了阳离子纳米脂质体的化学稳定性和生物可降解性。

醚键和C-N键的化学稳定性较高，但不易被生物降解，一般不适用于体内实验；

含有酯键的阳离子纳米脂质体较易被生物降解，细胞毒性小，但它们的化学稳定性通常较差。

通常采用的连接键是化学稳定性较高、但又可以生物降解的酰胺键和氨甲酰键等。

常见的阳离子纳米脂质体的疏水烃尾主要有脂肪烃基链和胆固醇环。

脂肪烃基链的碳原子数通常为12至18个，以达到在生理温度下为脂双层提供足够的流动性，又能使脂双层膜维持一定的刚性，以便为阳离子纳米脂质体在体内的脂质融合创造条件。

对以脂肪链为尾部的脂质体，碳链加长会导致转染效率降低，但在链内引入不饱和键可提高效率。

将胆固醇用作疏水烃尾，效果常常优于脂肪链，因为由它参与形成的双分子层结构更稳定。

表7-1内列出了目前常用的一些阳离子纳米脂质[9,10]。

2辅助脂质

辅助脂质主要有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）等。

二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）是应用最广的一种辅助脂质，可与阳离子脂质形成稳定的纳米脂质体，与DNA等具有良好的融合性。

该脂质在阳离子脂质体与DNA形成复合物、复合物进入细胞、复合物从内涵体脱离以及DNA与阳离子纳米脂质体分离的过程中都起着重要的作用。

因此，DOPE已被广泛应用于阳离子纳米脂质体基因转移系统中以提高基因的转染效率。

目前最常使用的脂质体，如DOTMA/DOPE脂质体、DOSPA/DOPE脂质体、DDAB/DOPE脂质体都含有DOPE，其中DOTMA、DOSPA、DDAB作为阳离子脂质靠静电作用与核苷酸结合，而DOPE则作为可融性脂质促进阳离子脂质与细胞膜的融合。

若用DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱）代替DOPE，脂质体的融合性下降，转染效率也随之降低。

这正是DOPE成为“脂质伴侣”的原因[11]。

而以Chol为辅助脂质的阳离子脂质体虽然稳定性提高，但转染效率却降低。

此外，加人大相对分子质量的阳离子聚合物，如聚赖氨酸（PLL）或硫酸鱼精蛋白，可减小复合物的粒径，有效避免DNA被核酸酶降解，从而提高转染效率[12,13]。

表7-1用于制备阳离子纳米脂质体的常见阳离子脂质

缩写名

化学名

DOTMA

氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵

DOTAP

溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵

DOSPA

三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-（2-精胺甲酰氨基）乙基铵

DTAB

溴化三甲基十二烷基铵

TTAB

溴化三甲基十四烷基铵

CTAB

溴化三甲基十六烷基铵

DDAB

溴化二甲基双十八烷基铵

DORI

溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵

DORIE

溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵

DORIE-HP

溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵

DORIE-HB

溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵

DORIE-HPc

溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵

DPRIE

溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵

DSRIE

溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵

DMRIE

溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵

DOGS

N-（2-精胺甲酰基）-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺

DOSC

1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯

DC-Chol

3β-[N-（N’，N’-二甲基胺乙基）胺基甲酰基]胆固醇

LPLL

脂质多聚-L-赖氨酸

SA

硬脂胺

7.2.2阳离子纳米脂质体的结构

脂质体的体内过程除与脂质的化学组成相关外，还与脂质体的大小和形状等特性有关。

脂质体的直径约在25nm~1000nm范围内，甚至更大。

它们可由单层双分子膜组成，也可由多层双分子膜组成。

按脂质体的大小和脂质双层数目可将纳米脂质体分为以下几类：

小单层纳米脂质体（smallunilamellarvesicles，SUVs）：

SUVs是具有脂质双分子层的最小单位，其大小根据介质的离子强度和膜的脂质组成不同而不同，一般在20nm~100nm之间。

大单层纳米脂质体（largeunilamellarvesicles，LUVs）：

LUVs是指直径大于100nm的单层脂质体。

多层纳米脂质体（multilamellarvesicles，MLVs）：

MLVs是由双分子层与水交替形成的囊泡。

纳米脂质体的直径大都在300nm~700nm之间，组成MLVs的磷脂双分子层有五层或更多，层数较少的有时也称为少层脂质体（oligolamellarliposomes）。

曾有研究表明，在脂质组成一定的情况下，MLVs与DNA形成的复合物转染效率要高于SUVs-DNA复合物[14]。

然而，Ross等利用最近提出的一种优化脂质-DNA复合物性质的方法进行的研究表明，由SUVs或MLVs与DNA形成的复合物的粒径差别并不十分显著（均在300nm~2000nm之间，只与制备时所用的介质有关），细胞吸收的程度也较相近，转染效率仅与形成的复合物的最终粒径有关[15]。

产生这一现象的原因被认为是在复合物形成过程中，DNA会诱使SUVs向MLVs转化。

对于人工合成的阳离子纳米脂质体，细胞会产生较强的排异作用，这可能限制其在体内的应用。

由SA和DOPE按质量比1:

1制备的脂质体是目前已知的完全由天然脂质体所构成的阳离子纳米脂质体，它对机体的免疫原性小，可能今后会在基因治疗上得到较好的应用。

表7-2列出了已商品化的阳离子脂质体[16]。

表7-2已商品化的阳离子脂质体

阳离子脂质体

组成成分

厂商

Lipofectin

DOTMA/DOPE=1：

1（质量比）

GIBCOBRL

Boehringer、Mannheim

TransfectACE

DDAB/DOPE=1：

3（摩尔比）

LipofectAMINE

DOSPA/DOPE=1：

Transfectam

Promega

TfxTM-50

TfxTM-50/DOPE

DC-Chol/DOPE=1：

1（摩尔比）

Sigma

7.2.3阳离子纳米脂质体介导基因转移的机制

自1987年首次应用阳离子纳米脂质体转移基因取得成功以来，阳离子纳米脂质体介导基因转移的研究取得了一系列的进展。

但是，关于纳米脂质体-基因复合物被细胞摄取的机理及复合物在细胞内的转运过程尚未完全阐明。

其可能的机理是：

首先，阳离子纳米脂质体与带负电的基因通过静电作用形成纳米脂质体-基因复合物，此复合物因阳离子纳米脂质体的过剩而带正电；

带正电的纳米脂质体-DNA复合物由于静电作用吸附于带负电的细胞表面，然后通过与细胞膜融合或细胞的内吞作用进入靶细胞。

在细胞内，阳离子纳米脂质体-基因复合物发生分离，基因进一步被转运到细胞核内，并在细胞核内转录和翻译，最终产生目的基因编码的蛋白质[17-19]（图7-1）。

图7-1阳离子纳米脂质体介导基因转移示意图

1阳离子纳米脂质体与基因形成复合物

（1）复合物的形成及结构

阳离子脂质的正电荷头部与基因上带负电荷的磷酸酯基团之间的静电引力是纳米脂质体-基因复合物形成的主要推动力。

纳米脂质体与DNA相互作用和影响，DNA可以诱导脂质体之间发生融合，而与此同时DNA的形态也会发生显著的改变。

脂质融合是指当两种不同形态的脂质混合时，两种脂质双层结构发生复合形成新的脂质双层结构的过程。

它能由某些因素所诱发，如一些脂质、肽类的接近或pH值的变化。

在纳米脂质体与DNA复合以及复合物在细胞内的转运过程中，脂质融合的作用是很重要的[20]。

Litzinger等[21]在研究了脂质体在水中的多种形态后，认为纳米脂质体在水中最重要的两种存在形态是L相和HII相。

L相是一种具有流动性烃链的层状结构，而HII相是一种二维的六方晶相结构。

两相之间发生转变的温度被称为六方晶相转变温度（TH），具体过程如图7-2所示。

图7-2纳米脂质结构由L相到HII相的转变

Cullis和Kruijff[22]研究了易形成六方晶相构型的脂质的一些基本结构特征。

在六方晶相结构中，脂质头部基团呈高度弯曲的形状。

由于空间位阻的原因，含有小极性头部基团（如磷酯酰乙醇胺，PE）的脂质比含有大极性头部基团的脂质更易形成六方晶相的构型。

极性头部的有效体积还进一步受到静电排斥力和氢键的影响。

疏水烃链链长的增加与饱和度的降低（特别是形成反式构型）有利于六方晶相构型的形成。

由L到HII相转变过程中，脂质最有利的分子构型是锥状（如小的极性头和大的疏水烃链），而圆柱状的脂质有利于形成双层结构，反锥状的脂质（大的极性头部和小的疏水链）则易形成胶束结构。

阳离子纳米脂质体与DNA的相互作用（可用冷冻蚀刻电镜技术、荧光光谱、核磁共振、X射线衍射等方法进行研究）有如下几种模式：

静电模型：

DNA靠静电吸引力结合在阳离子纳米脂质体的外表面。

Felgner[23]认为一个直径为250nm的纳米脂质体约含2500个脂分子，其中有一半为阳离子脂质分子，而一个长度为2.5kb的质粒DNA分子含有5000个净负电荷，这样一个质粒可结合4个纳米脂质体。

内含模型：

带负电的DNA完全进入纳米脂质体内部，并靠电荷吸附在阳离子纳米脂质体内层表面，或悬浮在纳米脂质体内部溶液中。

Gershon等[24]研究证明，当DNA与DOTMA/DOPE阳离子纳米脂质体结合时，DNA萎缩成一种凝聚状的结构，被纳米脂质体所包围。

当开始加入的脂质体的量较低时，阳离子纳米脂质体结合在DNA分子表面形成聚集的囊泡；

当连续加入阳离子脂质体使其浓度达到临界脂质浓度时，DNA诱导的纳米脂质体融合和纳米脂质体引起的DNA压缩开始发生，最终形成了阳离子脂质双层包裹的DNA复合物。

细面条模型：

线性DNA的周围包围着脂双层结构，DNA与脂分子间靠静电吸引，脂分子呈线型排列在DNA的周围。

Sternberg等[25]用冷冻蚀刻电镜技术研究表明DNA在结合过程中折叠成各种紧凑的结构，最终被融合成管状的脂质体包裹成为一种明显的“杆状”结构，提出了单超螺旋DNA棒状链被一层单脂双层膜所覆盖的模型（图7-3）。

图7-3纳米脂质体-DNA杆状模型

模型：

Rä

dler等人[26]研究发现，阳离子纳米脂质体与DNA混合后结构发生改变，形成一种液晶态、浓缩并呈球状的结构。

线性DNA部分插入纳米脂质体内部，纳米脂质体的某一部位双层断开并允许线性DNA分子进入，DNA与纳米脂质体结合。

在此过程中，DNA可以分布在脂质体内外两层，最大限度地中和纳米脂质体正电荷。

“蜂窝”模型：

在DOPE存在的情况下，阳离子纳米脂质体由层状构型向六方晶相构型转变，同时DNA被阳离子脂质单分子层包裹并排列成二维的六方晶格结构（即“蜂窝”状结构）[27,28]。

阳离子纳米脂质体-DNA复合物呈现的形态结构可能多种多样，也不能排除几种结构同时存在的情况。

制备过程中某个条件的改变甚至是采用不同仪器进行观测，都有可能得到不同的结果。

（2）复合物的理化性质

复合物的理化性质主要包括粒径、zeta电势及胶体化学稳定性等，这些性质对转染效率的高低起着决定性的作用。

影响复合物理化性质的因素有热力学上的，也有动力学上的，主要包括阳离子纳米脂质体与DNA的浓度、介质的离子强度与温度、样品加入的顺序、混合的速率等[29,30]。

阳离子纳米脂质体与DNA正负电荷比（+/-）将强烈影响复合物的理化性质，并最终影响其转染效率。

尽管不同的研究者对这一比例的确切数值看法不尽相同，但普遍认为应大于1。

体外实验表明，阳离子纳米脂质体的比例越高，转染效率就越高，而细胞毒性也随之增大。

因此，使用合适比例的阳离子纳米脂质体与DNA才能达到最佳的转染效果。

一般认为，纳米脂质体-DNA复合物带有过量正电荷对转染很关键，可增强与带负电荷的细胞膜的结合力，使进入细胞的复合物的量增加。

由于血清蛋白带负电荷，与阳离子纳米脂质结合一方面可以使DNA从复合物中离解而被降解，另一方面也会造成复合物凝聚，最后通过网状内皮系统排出。

复合物表面过量的正电荷可以减小或消除这些影响[31]。

不过，也有人[32]发现DC-Chol/DNA复合物在最佳转染条件下，正负电荷比例小于1，复合物带负电荷并不影响转染效率。

造成这一现象的原因可能是体系内只有部分DNA与纳米脂质体形成复合物，或者细胞表面存在DNA的特异受体。

复合物的粒径通常比纳米脂质体的粒径稍大，它在一定程度上受纳米脂质体和DNA两者的正负电荷比的影响[33-35]。

当复合物带过量正电荷时，DNA被高度浓缩，粒径较均一，平均在100nm~450nm范围内。

当复合物带过量负电荷时，粒径分布与上述情况基本类似（尽管这种情况下通常存在游离的DNA）。

而当阳离子脂质与DNA的正负电荷比为1时，此时复合物呈电中性，其平均粒径在350nm~1200nm范围内。

由于缺乏静电排斥作用而易聚集，稳定性差。

若固定正负电荷比而增加阳离子脂质与DNA的浓度，则复合物粒径增大，稳定性降低，这是因为在高浓度下粒子间间距的减小易导致其沉降。

Nakanishi等[36]的研究结果表明，复合物粒径在0.4μm~1.4μm时，转染效率最高；

其次是粒径在1.4μm~2.0μm范围内；

而粒径在400nm以下的复合物的转染效率最低。

这可能是粒径较大的复合物可携带较多量的DNA，且只有特定尺寸大小的粒子才能通过内吞作用进入细胞。

在低离子强度的介质中，纳米脂质体与DNA间形成复合物所需的静电吸引力增大，这使得阳离子纳米脂质体与DNA之间的相互作用更加紧密，从而减少了粒子的聚集和沉降。

因此，阳离子纳米脂质体-DNA复合物通常是在离子强度较低的溶液中进行制备的。

在一定范围内，介质温度（只要不会引起DNA变性）对复合物的形成及其性质的影响较小。

此外，阳离子纳米脂质体与DNA溶液的混合速度和方式对阳离子纳米脂质体-DNA复合物的形成有很大的影响。

研究表明，快速混合得到的复合物的粒径较小，而缓慢混合则会导致聚集和沉淀的形成[37]。

此外，为了避免易聚集的中性复合物的形成，若要制备带正电荷的复合物，应该向阳离子纳米脂质体溶液中加入DNA；

反之亦然。

2阳离子纳米脂质体-DNA复合物与细胞外物质的相互作用

当阳离子纳米脂质体-DNA复合物进入体内后，它将同细胞外的一些物质发生相互作用。

这些物质包括：

血液成分（如红细胞、蛋白质、脂蛋白等），细胞外介质（糖蛋白，如硫酸软骨素、胶原等）和粘膜分泌物（如透明质酸、粘蛋白等），具体随给药方式不同而异。

较高的离子强度尤其是多价阴离子对脂质-DNA复合物施加的影响作用较大。

将DOTAP-寡核苷酸（oligonucleotide）复合物加至离子强度较高的培养基质中，脂质易发生融合，形成六方晶相构型，复合物的粒径分布也发生改变[38]。

若复合物内含有DOPE，则这种变化更加明显。

由此可见，纳米脂质体-DNA复合物在细胞外基质中易受各种离子和大分子物质的影响，使其稳定性大大下降。

值得一提的是，血浆中的白蛋白会吸附到阳离子纳米脂质体-DNA复合物上，使复合物的ξ电位降低，从而减少复合物之间的静电排斥力，最终导致复合物的聚集[39]。

过度的聚集还会引起复合物在毛细血管壁上的沉积。

尽管在血浆中确实存在纳米脂质体-DNA复合物的聚集现象，由于聚集体的直径通常在lμm以下，比正常的红细胞体积还小，因此很可能可以通过细胞内吞作用而被摄取，内皮细胞上表达的针对变性白蛋白的受体可能参与这一过程。

在血浆的影响下，阳离子纳米脂质体-DNA复合物的转染效率通常较低，这可能是DNA从复合物中提前释放所致。

血浆中存在大量的生物大分子和核酸酶。

一些带阴离子基团的细胞外物质（如肝