实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及其病理学和影像学表现Word格式.docx

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EAE小鼠脑和脊髓小血管周围炎细胞浸润呈袖套状或脱髓鞘改变，神经元变性及轴突损伤，MRI可显示脑和脊髓病灶。

结论：

应用背部、颈部、腋窝、蹊部多点注射可提高EAE发病率，1次免疫与两次免疫小鼠对EAE发病率的影响没有明显差别。

【关键词】脑脊髓炎；

脑；

脊髓；

神经元；

磁共振成像；

小鼠

　　［Abstract］Objective:

Toestablishautoimmuneencephalomyelitis（AE）mousemodelandobserveitspathologicalandimagingappearance,andsoastoprovideabasisforstudyofpathologicalmechanismandtherapyofmultiplesclerosis.Methods:

EightyC57BL/6femalemiceweredividedrandomlyinto6groups,with15ineachofgroupsofEAE1,EAE2,EAE3,andEAE4.Experimentalautoimmuneencephalomyelitis（EAE）wereinducedinmiceofthe4groupswith300μgofMOG35-55pluscompleteFreund‘sadjuvant（CFA）bydifferentmethods.Miceinadjuvantgroup（groupADJ,n=10）weretreatedwithCFAplusnormalsaline,whilemiceincontrolgroup（groupCON,n=10）treatedwithnormalsalineonly.MRIexaminationandpathologicalobservationonthebrainandspinalcordwerecarriedoutonmiceingroupsofEAE1,ADJ,andCON.MethodsusedinpathologicalobservationincludedHEstaining,LuxolFastBluestaining,andBieschowskysilverstaining.Results:

ClinicalsymptomsofEAEappearedinmiceofgroupsEAE1,EAE2,EAE3,andEAE4in14daysafterimmunization,andtheincidenceswere80%,80%,73%,and67%respectively.ClinicalsymptomscoresofgroupsEAE2andEAE3werenotstatisticallydifferentfromthatofgroupEAE1（P＞）,whilethatofgroupEAE4hadstatisticallysignificantdifferencefromthatofgroupEAE1（P＜）.NoobviousEAEsymptomwasfoundingroupsADJorCON.Pathologicalobservationshowedinflammatorycuffaroundsmallbloodvessels,demyelization,degenerationofneurons,andaxonalinjuryinbrainandspinalcordofmiceinEAEgroups.FociofdiseaseinbrainandspinalcordwereshowedbyMRI.Conclusions:

Multipointinjectionatback,neck,armpit,andgroincouldincreasetheincidenceofEAE.TwiceinjectionofreagentdoesnotmakesignificantdifferencefromonesingleinjectionintheincidenceofEAE.

　　［Keywords］encephalomyelitis;

brain;

spinalcord;

neurons;

magneticresonanceimaging;

mice

　　多发性硬化是一种主要累及中枢神经系统的炎症性、多发性的脱髓鞘自身免疫性疾病，具有症状复杂多变、缓解与复发交替进行、病程迁延不规律等特点，迄今尚未完全明确其病因和发病机制[1]，也没有特效的治疗方法。

实验性自身免疫性脑脊髓炎是一种由活化T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，主要病理特征为血管周围炎性细胞浸润和神经脱髓鞘反应，在临床症状、生化指标及病理等方面与MS具有相似的特征，因此EAE被认为是研究MS的良好动物模型。

2009年3月～2009年7月，参照国内外文献报道的方法[2，3]，以完全弗氏佐剂与MOG35-55制备的乳化抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，成功建立了C57BL/6小鼠的EAE模型，通过病理学和影像学鉴定该模型的可靠性，为进一步研究MS的发病机制和治疗方法奠定动物模型基础。

　　1材料与方法

　　主要试剂

　　MOG3555多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK购自西安美联多肽合成有限公司，纯度97%，-20℃保存备用；

国产百日咳毒素由成都生物制品研究所馈赠，卡介苗购自中国药品生物制品检定所；

进口百日咳毒素、Luxolfastblue、焦油紫、完全弗氏佐剂、硝酸银均购自美国Sigma公司；

结核杆菌H37Ra购自美国Difco公司，重铬酸钾、碳酸锂、伊红等化学试剂购自恒因生物有限公司。

　　实验动物及分组

　　雌性C57BL/6小鼠80只，4～8周龄，体质量15～20g，购自重庆医科大学动物室。

按照随机对照分组的原则将小鼠分为6组：

EAE1组、EAE2组、EAE3组和EAE4组，每组15只，佐剂组和对照组各10只。

　　EAE模型制备

　　用mol/L的PBS将MOG35-55稀释成300mg/L，然后将稀释液与等量的完全弗氏佐剂（卡介苗的终浓度为10g/L或结核杆菌H37Ra终浓度为5g/L）混合，用玻璃注射器抽打至油包水状态，制成诱导EAE的抗原乳剂。

佐剂组则以生理盐水代替抗原肽制备免疫乳剂，对照组仅注射生理盐水。

EAE1组、EAE2组小鼠分别于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原（卡介苗的终浓度为10g/L）ml/只，EAE4组小鼠于背部四点皮下注射相应抗原（卡介苗的终浓度为10g/L）ml/只，EAE3组小鼠分别于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原ml/只，免疫当天为第0天。

于第0、2天给予EAE1组、EAE2组、EAE4组和佐剂组小鼠腹腔注射国产百日咳毒素mg/只，给予EAE3组注射进口百日咳毒素mg/只。

于第7天给予EAE2组小鼠再次于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原（卡介苗的终浓度为10g/L）ml/只。

　　体重监测及神经功能评分

　　第0天开始，每日称体重，观察小鼠的摄食情况，并采用双盲法每天两次进行神经功能评分，评分标准为通用的0～5级评分法：

0级，不发病；

1级，小鼠尾部张力降低或麻痹；

2级，小鼠尾部麻痹，后肢无力；

3级，小鼠后肢瘫痪；

4级，小鼠四肢瘫痪，人为翻身不能复位；

5级，濒死状态或发病后死亡。

　　组织取材与影像学、病理学检查

　　小鼠发病后第3天，EAE1组、佐剂组、对照组分别取5只小鼠予10%水合氯醛麻醉后放在柔性线圈中间行常规脑和脊髓MRI检查。

影像学检查后将动物断颈处死，立即在无菌条件下取出脑；

一次性20ml无菌注射器用灭菌生理盐水冲出完整的脊髓，其中部分立即浸入4%多聚甲醛液中固定12～24h，冰冻切片，同一部位5μm切片行HE染色和30μm切片用常规方法行LuxolFastBlue染色；

另一部分用常规方法行Bielschowskys银染。

在光镜下观察炎性细胞浸润、脱髓鞘改变及轴突损伤。

　　统计学方法

　　计量资料均以表示，采用SPSS统计软件进行数据分析，组间比较采用F检验及t检验，为差异具有显着性意义。

　　2结果

　　临床表现

　　免疫后每天对小鼠进行临床评分，EAE1组、EAE2组、EAE3组、EAE4组小鼠免疫后第14～19天开始陆续发病，发病前毛色发暗，活动减少，食欲较差，反应迟钝，发病率为80%、80%、73%、67%。

首发症状多为尾部远端无力下垂，体重明显减轻，临床评分随着时间延长加重，第18～22天为高峰，表现为尾部完全松弛无力，蹒跚步态，后肢或四肢瘫痪，人为翻身不能及不能站立等。

发病高峰过后，EAE小鼠的体重逐渐恢复，症状有所缓解，但直至第35天仍有部分小鼠遗留有尾部拖垂的症状。

EAE2组、EAE3组小鼠临床症状评分与EAE1组比较，P＞。

EAE4组小鼠临床症状评分与EAE1组比较，P＜。

佐剂组和对照组均未出现临床神经系统症状（表1）。

表1各组临床表现比较注：

（1）与EAE1组比较；

（2）与EAE1组比较。

　　脑和脊髓病理学改变

　　佐剂组和对照组小鼠的脑和脊髓HE、LFB染色和Bielschowskys银染均未发现明显异常改变。

EAE1组小鼠发病第3天HE染色可见脑干、小脑、大脑和脊髓白质区内有不同程度的炎性细胞浸润，以脊髓、脑干最常见，多见于小血管旁，呈血管袖套样改变；

神经细胞肿胀、变性、坏死；

大脑皮质下的白质区可见散在胶质细胞聚集及胶质小结形成，甚至能看见噬神经现象。

LFB染色可见在脑和脊髓白质中有大小不等的片状髓鞘脱失区。

Bielschowskys银染可见脑和脊髓有轴突呈节段性损伤。

　　MRI扫描

　　佐剂组和对照组小鼠脑和脊髓MRI扫描均未发现明显病灶。

EAE1组小鼠发病第3天行脑和脊髓冠状位（图4A）与轴位百日咳毒素和卡介苗是免疫原性的佐剂，实验中发现，同等浓度的国产百日咳毒素、卡介苗用量需是进口百日咳毒素和H37RA结核分枝杆菌的两倍才能有效免疫动物，应用国产试剂价格便宜，只要把握好剂量同样能得到理想的EAE小鼠，有利于该模型的推广应用；

应用背部、颈部、腋窝、蹊部多点注射与仅背部多点注射相比较,能提高发病率；

有文献报道，需两次注射MOG3555抗原加完全弗氏佐剂免疫乳剂诱导发病，本实验发现1次给药与两次给药对发病率的影响没有明显差别；

本实验采用Bielschowskys银染显示了EAE小鼠模型的轴突损伤病理性特征，与国内外报道相一致；

（5）影像学提示的病变位置与病理学结果相一致，病灶呈多发性，但主要集中于小脑、脑干和脊髓，而人类多发性硬化脑部病灶多见于脑室系统周围，其次才是胼胝体与脑室之间、小脑、脑干、基底节区及灰质，提示EAE小鼠主要发病部位与人类MS不完全相同，与国外报道相同。

　　本次实验所复制的慢性EAE模型具有发病率高、死亡率低、模型稳定、动物来源方便、其病理改变更加接近MS，是研究MS的一种理想的动物模型，为进一步的研究提供了动物准备。

【参考文献】

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