DGGE实验操作步骤详细资料Word文档下载推荐.docx
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(6)上样缓冲液(如实验室有现成的6X或10Xloadingbuffer,则不需配该项了)
(7)核酸染色剂(EB,GOLDVIEW,SYBRGREEN等核酸染色试剂均可以)
(8)可以进行染色和脱色的容器,磁盘或饭盒等,长宽20cm以上
(9)移液器、枪头
实验前请先确定配置多大浓度的胶以及变性浓度的范围(如20%-70%或者30%-60%,最好可以在相关文献中查到)。
不同浓度的胶适用于不同片段大小的分离。
变性浓度的范围直接关系到片段的分辨力。
变性浓度为0%和100%的溶液可配置,作为储存液,用来实验时配置成不同变性浓度的胶。
详细的配置方法以及所需试剂请参考以下图片。
2,所需其它仪器设备
(1)电源(伯乐公司的basic和HV均可)可以设置电压至200V左右。
(2)核酸成像设备
可以进行核酸的紫外成像仪,成像面积最小16cmX16cm
3,如果需要跑用户自己的样品,请提前准备好尽量新鲜的PCR产物,最好先经过琼脂糖电泳验证条带是否单一,以及亮度如何(上样量为180-300ng/well),储存于-20°
C。
二、现场培训
检查仪器外包装、清点仪器及配件,跟用户现场确认。
1,梯度胶的组装和灌制
475梯度仪和注射器等小组件的组装请参考下图
不同尺寸大小的玻璃板及不同垫片厚度的组合,所需要胶的总体积、每个注射器所需的体积和475生成仪上的体积调整设置(上图中volumesettingindicator)都是不同的,具体参考下图
(1)组装制胶架
DGGE实验推荐使用16X16cm的玻璃板组件。
戴手套和口罩进行操作。
在一个干净的平稳的场所,提前将玻璃板、垫片、海绵垫片等小组件彻底清洗干净晾干(新
的可直接用)。
使用非凹槽的垫片,将其放置于长短玻璃板两侧之间,注意垫片上侧的小孔的位置,不可
随意更换。
按照以下图片,将两个夹子将带有垫片的两个玻璃板左右夹紧,下端平整,然后用纸卡片插入两个玻璃板中间,调整垫片的位置和两个夹子的松紧,确保组装的密闭性,玻璃板上端平整,垫片的位置整齐,否则在实验中漏胶或buffer
(2)灌制梯度胶
a,将海绵垫固定在制胶架上,把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方,用
分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统,注意将短玻璃的一面正对着自己。
b.共有三根聚乙烯细管,其中两根较长的为15.5cm,短的那根长9cm。
将短的那根与Y
形管相连,两根长的则与小套管相连,并连在30ml的注射器上。
注意管内不要有残留
的胶液或者水等杂物。
c.在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’,并安装上相关的配件,调整梯度传
送系统的刻度到适当的位置!
例如16*16cmgels(1mmthick):
设体积调整装置到14.5。
d.反时针方向旋转凸轮到起始位置。
为设置理想的传送体积,旋松体积调整旋纽。
将体积
设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置,旋紧体积调整旋纽。
例如16*16cm
gels(1mmthick):
e.配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。
如选择的浓度范围是20%-70%,则需要通过计算,分别加入不同量的0%和100%储存液来分
别配置。
以配置15ml的20%的胶为例,X为加入0%的体积,Y为加入100%的体积
X+Y=15
X0%+Y100%=15x20%
即可计算出X和Y各加多少
以下的步骤是有时间限制的(7-10min)请确定上述5个步骤准备好了再进行以下操作,且需要对以下步骤操作熟练。
f.在两个离心管中加入APS和TEMED,使其终体积浓度为0.09%(V/V),迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。
用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶,对于低浓度的胶操作同上。
g.通过分别推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器,推动胶溶液到聚丙烯管的末端。
注意不要将胶液推出管外,因为这样会造成溶液的损失,导致最后凝胶体积不够。
操作过程难免有浪费和误差,所以配置的胶的体积应该比设置体积多一些,如设置的14.5,则可配置胶的体积可以为15ml
h.分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好,注意这里一定要把
位置放正确!
(475梯度仪上标注好了topfilling哪面放置高浓度注射器哪面放置低浓度注射器)
i.将两个注射器的聚丙烯管同Y形管相连,Y型管的另一头连接第三个聚丙烯管(9cm)
j.把针连接到聚丙烯管上,放置于玻璃板的中间位置,为了方便,可以用小夹子使其固定。
k.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液,在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地
推动凸轮,以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中。
l.小心插入梳子,让凝胶聚合大约一个小时。
m.尽快清洗注射器和聚丙烯管等,避免残留的胶凝聚后不容易清洗。
注意,待胶凝聚的时候正好可以提前打开电泳控制设备,将缓冲液预热至60°
C,这样可以更节省时间
2.“三明治芯”的组装
(1)确保浅黄色的“三明治芯”上面的U型白色垫片封闭性好,且干净,无凝胶等附着在
垫片上面
(2)将已经凝聚好的胶夹子整体从制胶底座上拿下来,并小心的取下梳子
(3)将玻璃板固定到三明治芯上,短板在三明治芯的里面,长板在外面。
如同时跑两块胶,
则另一面也同样安装好玻璃板,这样在三明治芯的上端就形成了一个上部的电泳上槽。
如果只跑一块胶,则另一面的玻璃板中间不用放垫片即可。
同样安装到三明治芯上。
(4)将约350ml的runningbuffer倒入上槽内,目的是确认漏不漏液,如果有漏液的情况,
则需将buffer先倒出,重新组装玻璃板,直至不漏液为止。
(tips可以在U型垫片上滴
几滴buffer以便增加润滑性和密闭性)
3.加缓冲液、上样、运行
(1)在电泳槽中加入7Lrunningbuffer
(2)待温度升至设定温度时,关闭系统,将温度控制模块搬下,先放置于黑色的铁架子上,将上述安装好的“三明治芯”放入电泳槽内,注意“三明治芯”上的红色按钮在右边,黑色按钮在左边。
最后再将温度控制模块放上去。
(3)打开power、pump、heater按键。
拿掉clearloadinglid(放在温度控制模块上面的透明的带有电极的长方形组件),用移液器吸取buffer吹洗一下加样孔附近未完全凝聚的碎胶等杂物。
将loadinglid放回,按紧。
(4)缓冲液的温度回升至设定温度,需要大概10-15min
(5)将loadinglid拿掉,同上吹洗点样孔,小心点样(最好用测序胶用的枪头,前端很长很细),将loadinglid放回,按紧。
(6)在电源上设置好电压,开始运行程序。
对于DGGE\CDGE推荐电压130V,不能超过180V。
电压过高电泳过程热量影响电泳结果。
对于TTGE推荐130V,不能超过150V。
电压过高电泳过程热量影响温度梯度
4.电泳结束、成像
(1)关闭按钮(heaterpumppower)关掉电源。
让heater在buffer里冷却约1min
(2)搬走温度控制模块,将“三明治芯”上槽中的buffer倒入电泳槽里。
(3)拆开“三明治芯”,松开制胶夹子,将玻璃板拿下来。
将玻璃板中间的垫片拿出,掰开两块玻璃板,此时胶会自然的脱落在一个玻璃板上。
为了方便操作,可以将胶和一块玻璃板一起进行染色。
(4)250mlrunningbuffer内进行染色(EBSYBRGREENGOLDVIEW均可)
(5)脱色,成像。