细胞生物学全套资料第三章细胞生物学研究方法文档格式.docx

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D分辨率

λ波长，最短可见光波长λ＝450nm

α物镜镜口角，通常α最大值可达140º

N介质折射率，空气中N=1

D＝292nm，约0.3微米

油镜：

N可提高到1.5，

D值可达0.2微米

普通光镜的最大分辨率＝0.2微米

表2-1介质的折射率

介质

空气

水

香柏油

α溴萘

折射率

1

1.33

1.515

1.66

光学显微镜的放大倍数

*普通光线的波长，为400～700nm

显微镜分辨力数值，不会小于0.2μm

*人眼的分辨力是0.2mm

一般显微镜设计的最大放大倍数，通常为1000X。

普通光镜样品的制备：

材料的固定（如甲醛等）→包埋（ 

如石腊）→切片（厚度5微米）

观察前一般需要染色：

*伊红、美蓝：

能特异性地与不同蛋白质结合

*品红：

DNA染色

（二）荧光显微镜

图2-2尼康E800荧光DIC显微镜

荧光的产生：

*细胞中某些物质

如叶绿素，受紫外线照射后可发荧光

*有些物质本身，不能产发荧光

用荧光染料or荧光抗体染色后→经紫外线照射亦可发荧光

*荧光显微镜，是能进行定性＆定量研究的工具之一

图2-3落射式照明原理

荧光显微镜＆普通显微镜，有以下的区别：

1. 

照明方式，通常为落射式

即，光源通过物镜，投射于样品上（图2-3）

2. 

光源波长较短，分辨力＞普通显微镜

3. 

有2个特殊的滤光片

光源前滤除部分可见光，保留459-490nm蓝色光

目镜、物镜之间

510nm的反射光

（2）

520-560nm进入视野（3），以保护人目

图2-4荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）图片来自http:

//www.itg.uiuc.edu/

（三）激光共聚焦扫描显微境

图2-5激光共聚焦扫描显微镜

图2-6LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，

图片来自http:

激光共聚焦扫描显微镜

（laserconfocalscanningmicroscope，图2-5、6）

1.用激光作扫描光源→逐点、逐行、逐面、快速扫描成像→扫描的激光＆荧光的收集，共用一个物镜→物镜的焦点，即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点

（样品一般经免疫荧光标记）

2.激光束λ较短，光束很细

激光共聚焦扫描显微镜，有较高的分辨力

大约是普通光学显微镜的2.4～3倍。

3.系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内

（类似扫描仪）

调焦深度不一样时，得到不同深度的图像

得到的图像信息都储于计算机内

通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构

4.激光共聚焦扫描显微镜

可用于观察细胞形态

也可用于细胞内

生化成分的定量分析

光密度统计

细胞形态的测量

（四）暗视野显微镜

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope，图2-7）

聚光镜：

*中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜

只允许被标本反射＆衍射的光线进入物镜

*视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的

此显微镜能见到，小至4~200nm的微粒子

分辨率，比普通显微镜高50倍

图2-7暗视野照明方式

（五）相差显微镜 

相差显微镜（phasecontrastmicroscope，图2-8、9）

*P．Zernike于1932年发明了相差显微镜

获1953年诺贝尔物理奖

*这种显微镜最大的特点

可以观察未经染色的标本和活细胞

相差显微镜的基本原理：

*把透过标本的可见光的光程差→变成振幅差

*提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见

相差显微镜，不同于普通光学显微镜：

1.环形光阑，位于光源＆聚光器之间

使透过聚光器的光线，形成空心光锥

焦聚到标本上

2.相位板

物镜中加了，涂有氟化镁的相位板

可将直射光or衍射光的相位，推迟1/4λ

此外，分为两种：

A+相板：

*将直射光推迟1/4λ

两组光波合轴后，光波相加，振幅加大

标本结构比周围介质更加变亮

形成亮反差（或称负反差）。

B+相板：

*将衍射光推迟1/4λ

两组光线合轴后，光波相减，振幅变小

*形成暗反差（或称正反差）

结构比周围介质更加变暗

图2-8相差显微镜照明原理

图2-9一种介壳虫的染色体（PCM照片）

（六）偏光显微镜（polarizingmicroscope）

*用于检测具有双折射性的物质

如，纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等

*与普通显微镜不同的是：

光源前有偏振片（起偏器）

使进入显微镜的光线为偏振光

镜筒中有检偏器

（与起偏器垂直的起偏器）

这种显微镜的载物台是可以旋转的：

①当载物台上，放入单折射的物质时

无论怎样旋转载物台

由于两个偏振片是垂直的

显微镜里看不到光线

②而放入双折射性物质时

由于光线通过这类物质时，发生偏转

旋转载物台，便能检测到这种物体

（七）微分干涉显微镜

（differentialinterferencecontrastmicroscope，DIC）

优点：

*能显示三维立体投影影像

*与相差显微镜相比

标本可略厚一点

折射率差别更大，故影像的立体感更强。

微分干涉差显微镜DIC

*光源，偏振光

*有四个特殊的光学组件：

偏振器

棱镜

滑行器

检偏器

*适于细胞的结构，特别是一些较大的细胞器

如，核、线粒体等

立体感特别强

适合于显微操作

像基因注入、核移植、转基因等显微操作

常在这种显微镜下进行

图2-10DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）

（八）倒置显微镜

*组成与普通显微镜一样

*物镜、照明系统颠倒（图2-11）

照明系统

↑

载物台

物镜

*用于观察培养的活细胞，具有相差物镜

图2-11莱卡倒置显微镜

二、电子显微镜

（一）透射电子显微镜

1、基本原理

光学显微镜：

*无法看清＜0.2µ

m的，显微结构or超微结构

*必须选择波长更短的光源，提高显微镜的分辨率

1932年Ruska发明了透射电子显微镜

（transmissionelectronmicroscope，TEM）

*电子束的波长≦可见光、紫外光

*电压越高，波长越短

*目前TEM的分辨力，可达近0.1nm

约为光镜的1000倍

电子显微镜＆光学显微镜区别（p52，表3-1）

光学显微镜

电子显微镜

分辨本领

200nm

100nm

接近0.1nm（1000）

光源

可见光

紫外光

电子束

波长

λ400-700nm

λ约200nm

0.01-0.9nm

透镜

玻璃透镜

电子透镜

真空

不要求

1.33×

10－5～1.33×

10－3pa

成像原理

利用样品对光的吸收，形成明暗反差＆颜色变化

利用样品对电子的散射＆透射，形成明暗反差

表2-2不同光源的波长

名 

称

X射线

α射线

0.1Kv

10Kv

波长（nm）

390~760

130~390

0.05~13

0.005~1

0.123

0.0122

电子显微镜的样品

*电子束的穿透力很弱

*电镜标本，须用超薄切片

厚度约50nm左右，需要用超薄切片机

电子显微镜：

放大倍数最高，可达近百万倍

由，①电子照明系统②电磁透镜成像系统

③真空系统④记录系统⑤电源系统等

图2-12JEM-1011透射电子显微镜

2、制样技术

（1）超薄切片

通常以锇酸＆戊二醛固定样品→以环氧树脂包埋→以热膨胀or螺旋推进的方式，推进样品切片（图2-13）→切片厚度20~50nm→切片采用重金属盐染色，以增大反差（图2-14）。

图2-13莱卡超薄切片机

图2-14内质网透射电镜图（伪彩色）

（2）负染技术

负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）→对载网上的样品染色→吸去染料→样品干燥后→在样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积→从而出现负染效果（图2-15）→分辨力可达1.5nm左右

图2-15肌动蛋白纤维的负染电镜照片

（3）冰冻蚀刻

冰冻蚀刻（冰冻断裂）

标本的制备：

样品在-100˚C干冰or-196˚C的液氮中冻结→用冷刀，骤然将标本断开→冰在真空升华→暴露出断面结构→称为蚀刻（etching）

样本的处理：

蚀刻后→向断面以45°

角喷涂一层蒸汽铂→再以90°

角喷涂一层碳→加强反差＆强度→然后用次氯酸钠溶液消化样品→把碳、铂的膜剥下来→此膜为复膜（replica）→复膜显示出了标本蚀刻面的形态→在电镜下得到的影像，即标本中细胞断裂面处的结构（图2-16）。

图2-16冰冻蚀刻电镜照片

（二）扫描电子显微镜

图2-17JEOL扫描电子显微镜

扫描电子显微镜：

（scanningelectronmicroscope，SEM，图2-17、18、19）

20世纪60年代问世

用来观察标本的表面结构，工作原理：

用一束极细的电子束，扫描样品→在样品表面激发出次级电子→次级电子的多少与样品的表面结构有关→次级电子由探测器收集→被闪烁器转变为光信号→经光电倍增管和放大器转变为电信号→显示出与电子束同步的扫描图像→图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

为了使标本表面发射出次级电子→标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

目前：

*扫描电镜分辨力，为6~10nm

*人眼：

0.2mm

*扫描电镜最大有效放大倍数：

0.2mm/10nm=20000X

人眼20000X

图2-18光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较

图2-19人类血细胞SEM照片

图片来自

（三）扫描隧道显微镜

（scanningtunnelingmicroscope，STM）

1981年Binnig等，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。

当原子尺度的针尖（类似探头）→在＜nm的高度上扫描样品时，电子云重叠→外加一电压（2mV~2V）时→针尖与样品之间产生隧道效应，电子逸出，形成隧道电流

电流强度：

与针尖、样品间的距离，有函数关系→当探针沿物质表面，在给定高度扫描时→因样品表面原子凹凸不平，使探针＆物质表面间的距离，不断发生改变→从而引起电流，不断发生改变→将电流的改变，图像化，即可显示出原子水平的凹凸形态。

扫描隧道显微镜

*分辨率很高

*固态、液态＆气态物质，均可进行观察

*普通电镜，只能观察制作好的固体标本

利用扫描隧道显微镜，直接观察生物大分子：

*如DNA、RNA、蛋白质等分子的原子布阵

*如生物膜、细胞壁等的原子排列

目前TEM的分辨力，可达近0.1nm

不同显微镜的放大倍数

*一般显微镜设计的最大放大倍数，通常为1000倍 

约为光镜的1000倍，人眼的1000,000倍

*横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm

三、显微操作技术

图2-20尼康NT-88NE显微操作/注射仪

（图片来自

显微操作技术（micromanipulationtechnique）：

在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（图2-20）进行细胞or早期胚胎操作的一种方法。

显微操作器：

用以控制显微注射针，在显微镜视野内移动的机械装置。

显微操作技术包括：

①细胞核移植②显微注射③嵌合体技术

④胚胎移植⑤显微切割等

细胞核移植技术已有几十年的历史：

①Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功

②我国著名学者童第周等

在鱼类细胞核移植方面，取得了丰硕成果

③多莉羊（体细胞）