模块3 灭菌与无菌操作技术Word格式文档下载.docx
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植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。
要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：
物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；
化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。
1.培养基用湿热灭菌
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
高压灭菌的原理是：
在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。
常用方法是：
关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20min。
按容器大小不同，保压时间有所不同见表4-1。
该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。
到达保压时间后，即可切断电源，在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。
不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。
一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易开了。
对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。
而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。
洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20～30min。
高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2～0.3单位。
高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。
在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。
培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。
环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。
在8％-20％蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15％～25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1％活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1％活性炭，蔗糖水解率可达5％。
为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法：
（1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。
（2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。
如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0．1％以下）注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。
如将磷、钙和铁放在最后加入。
（4）注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。
如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。
而96h后又回降至5.8左右。
这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
冷却后，立即使用。
操作中可采用250或500ml的广口瓶，放人95％的酒精，以便插入工具。
3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃的温度来杀死微生物。
由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。
干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。
包扎可用耐高温的塑料。
灭菌时应渐进升温，达到预定温度后记录时间。
烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。
干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4.不耐热的物质采用过滤灭菌
一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45um以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；
液量小时，可用注射器。
使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌
（1）紫外线灭菌
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。
紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。
紫外线的波长为200-300nm，其中以260nm．的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌；
而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
（2）熏蒸灭菌
用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。
这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。
另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。
还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5～8m1／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g／m3高锰酸钾氧化挥发。
熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。
冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌
物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％～2％的来苏儿溶液以及0.25％～1％的新洁尔灭也可以。
7.植物材料表面用消毒剂灭菌
单元Ⅱ外植体的选择与处理
一、外植体的选择
外植体是组织培养中的各种接种材料。
包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质等。
1.选择优良品种
作为良种繁殖的材料，必须准确选取优良的母株，种源可靠，性状稳定，或特殊的基因型，这样繁殖出来的试管苗才能具有典型的优良性状。
对试材的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功几率，增加其实用价值。
2.选择健壮植株
组织培养的试材，最好从生长健壮的无病虫害的植株上，选用发育正常的器官或组织，其代谢旺盛，再生能力强，组织培养容易取得成功。
3.选择最适时期
组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。
（1）确定取材部位
茎尖（少）、茎段、叶片、子叶、下胚轴（培养困难的植物）、根、花瓣、鳞茎等。
（2）器官的生理状态和发育年龄
同一植株上的器官具有不同的生理年龄，同种器官上的不同部位也有不同的生理年龄。
（选择幼年植物外植体，成年植物的下部幼年期部位）
（3）取材的季节和时间
选择生长期较幼嫩的植物
①春夏季取材灭菌容易
②秋冬取材难以成活
③雨季湿热季节不易成活（晴天的下午）
4.选择适宜的大小
外植体的大小，根据不同植物材料而异。
一般来说，较大的外植体有较强的再生能力，而小的则弱。
外植体太大易污染，太小多形成愈伤组织，甚至难以成活。
一般选取外植体的大小一般在0.5～1.0cm之间。
如果是脱毒，外植体则更小。
对于茎尖培养脱毒来说，去除病毒的可能性与外植体的大小成反比。
二、外植体的灭菌
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理。
1.外植体灭菌的流程
外植体在接种之前，须经严格的灭菌。
一般步骤如下：
把采来的材料事先截剪，除去不用的部分→将需要的部分仔细弄干净，用流水冲洗→肥皂水浸洗→自来水冲洗→70%~75%的酒精浸泡30s→灭菌剂灭菌→无菌水冲洗遍3~5遍→接种。
2.灭菌剂的种类
由于灭菌药剂的种类不同，其杀菌力也不同。
所以在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。
对不同的外植体处理也有不同。
幼嫩或敏感的材料处理时间不宜过长，也不宜采用强消毒剂。
一般采用消毒后易去除的消毒剂，如容易分解成无毒或低毒物的试剂，或者易被无菌水洗掉的试剂。
如清除不干净，残留在植物材料中的消毒剂会产生杀伤作用，妨碍组织培养中外植体的生长发育。
常见的灭菌剂有以下几种。
（1）75%酒精
比其他浓度的酒精杀菌效果强，组织穿透力也强。
它对材料气泡内空气进行杀菌，可以湿润材料，有利于其他消毒剂的渗入，具湿润和杀菌的双重作用。
酒精消毒时间不宜过长，浸渍30s可达表面灭菌。
因不能彻底杀菌，往往需用以下杀菌剂灭菌。
（2）氯化汞
这是一种重金属化合物，有剧毒。
对人、动物和植物的毒性非常大。
常用浓度为1%，处理时间5~10min，杀菌效果好，但残毒很大。
外植体灭菌后，需用无菌水冲洗至少3~5次。
（3）次氯酸钠
浓度可为2%~10%，消毒时间15~30min，杀菌效果比较好，很容易去除，对植物无害。
（4）漂白粉
这是一种常用的低毒的消毒剂，是含有多种成分的复合化合物，一般含10%~20%的次氯酸钙，使用浓度一般为5%~10%，或饱和溶液，取其上清液，处理10~30min，杀菌效果好，且不伤组织，容易洗净。
漂白粉要密封储藏，应随配随用。
（5）次氯酸钙
粉状，可以很好溶解于水，待澄清后取上清液用以消毒，常用浓度为35~100g/L，消毒时间为5~30min。
次氯酸钙进入植物组织内的速度低于次氯酸钠。
由于它易潮解，只能存储有限时间。
此外，还可以用过氧化氢（双氧水）、溴水、硝酸银、抗菌素等作为表面灭菌剂。
在灭菌处理时，可用磁力搅拌或人工搅拌，使外植体与灭菌剂有良好的接触。
如加数滴浓度为0.1%Tween20（吐温）或Tween80湿润剂于灭菌剂里，处理外植体效果更好。
单元Ⅲ接种与培养
一、外植体的接种—无菌操作
1.无菌操作
接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。
接种室内保持定期用1％～3％的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。
除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。
无菌操作可按以下步骤进行：
（1）在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；
（2）在接种前20rain，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；
（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等；
（4）上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。
然后擦拭工作台面；
（5）先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30rain。
若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
2.接种
接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放人培养基的过程。
以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍。
（1）将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。
（2）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。
如叶片切成0.5cm见方的小块；
茎切成含有一个节的小段。
微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。
在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。
具体操作过程是：
先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。
若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。
然后用镊子夹取一块切好的外植体送人试管内，轻轻插入培养基上。
若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。
至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。
放置材料数量现在倾向少放，通过统计认为：
对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培养基和大力，一旦培养物污染可以抛弃。
接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。
并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。
二、外植体的培养
培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。
1.培养方法
（1）固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。
是现在最常用的方法。
虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。
（2）液体培养法
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
2.培养步骤
（1）初代培养
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。
即接种某种外植体后，最初的几代培养。
初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。
初代培养建立的无性繁殖系包括：
茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。
根据初代培养时发育的方向可分为：
顶芽和腋芽的发育
采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。
在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽-苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。
然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。
一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。
这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。
适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。
茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。
它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。
在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。
用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。
但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。
不定芽的发育
在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。
然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。
多数情况下它先形成芽，后形成根。
另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。
当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。
许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。
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在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。
许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。
在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。
用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。
体细胞胚状体的发生与发育
体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。
但它是由体细胞发生的。
胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。
初代培养外植体的褐变
外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。
它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。
在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。
3.培养条件
接种后的外植体应送到培养室去培养。
培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。
其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。
（1）光照
光照对离体培养物的生长发育具有重要的作用。
通常对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适，但器官的分化需要光照。
光强：
1000～5000lx
光质：
波长
光时：
12～16h
（2）温度
不同植物生长的最适温度不同，大多数植物在23～32℃之间，培养室一般所用的温度是25℃左右。
低于15℃或高于35℃对生长都不利。
（3）湿度
组织培养中的湿度主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100％；
二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。
湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；
湿度过高时可用除湿机降湿，过低时可用喷水来增湿。
（4）氧气
植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。
在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。
在固体培养基中最好采用通气性好的瓶盖或瓶塞。
此外，愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质的枯竭，水分的散失，以及一些组织代谢产物的积累，必须将组织转移到新的培养基上。
这种转移过程成为继代培养。
一般在25～28℃下进行固体培养时，每个4～6周进行一次继代培养。
三、外植体的成苗途径
外植体的成苗途径有3种（图1-10）
第一种，外植体先形成愈伤组织，然后分化成完整的植株。
具体分化工程又可分3种。
（1）在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构，再发育成植株；
（2）在愈伤组织中先形成芽，后诱导成根，再发育成植株；
（3）在愈伤组织中最常见的再分化是先形成根，再诱导出芽，得到完整植株。
但在培养中一般先形成根的，往往抑制芽的形成；
而相反，一般先产生芽的，则以后较容易形成根。
第二种，形成胚状体，再发育成完整植株。
胚状体可以从以下几种培养物产生：
（1）直接从器官上发生
（2）从愈伤组织产生
（3）从游离单细胞产生
（4）从小孢子产生
在组织培养中诱导胚状体和诱导芽相比，有3个显著的优点:
（1）数量多，一个外植体上诱导产生胚状体数量，往往要比诱导芽的数量高得多；
（2）速度快，胚状体是以单细胞直接分化成小植株的，它比经过愈伤组织再分化成完整植株要快些；
（3）结构完整，胚状体一旦形成，即可长成小植株，成苗率高。
（4）胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存。
胚状体与不定芽的区别：
（1）最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎段和根端，而不定芽和不定根都为单项极性。
（2）胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。
（3）胚状体的维管组织是独立的“V”字形，而不定芽的维管组织无此现象。
第三种，外植体经诱导后直接形成根和芽，发育成完整的植株（如茎尖培养）。
图1-10外植体的成苗途径
小结
1.植物组织培养技术包括灭菌、接种、培养和驯化四个环节。
2.灭菌是指用物理或化学的方法杀死物体表面和孔隙内的微生物及其孢子。
消毒是指杀死、消除或抑制部分微生物的活动，使之不能再发生危害作用，不如灭菌彻底。
3.常用的灭菌方法有两种：
物理方法和化学方法。
干热、湿热、射线处理、过滤等属于前者；
升汞、来苏水、高锰酸钾、酒精等化学药剂处理则属于后者。
4.培养基一般采用湿热灭菌法；
耐热的玻璃器皿和器械一般采用干热灭菌法；
镊子等接种用工具则采用灼烧灭菌法；
不耐热的物质如生长调节剂等一般采用过滤除菌法。
5.高压蒸气灭菌前，要注意排净里面的冷空气；
保压时间到达后，要使指针回零才能开盖取物。
6.接种程序包括①植物材料表面的消毒；
②切割外植体；
③将外植体移人培养基。
7.培养方法主要有固体培养法和液体培养法。
前者是比较常用的方法，简便易行。
8.接种后材料的培养步骤可分为：
①初代培养；
②继代培养；
③生根培养。
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