药典三部版 通则 1143细菌内毒素检查法Word文档格式.docx

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式确定：

L=K/M

式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·

h）表示，注射剂K=5EU/（kg·

h），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg·

h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·

h）；

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·

h）、mg/（kg·

h）或U/（kg·

h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。

注射时间若不足1小时，按1小时计算。

供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

用以下公式来确定MVD：

MVD=cL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值；

c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。

如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L；

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

方法1凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的

内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml标示。

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。

取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×

75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支。

其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；

另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±

1℃的恒温器中，保温60分钟±

2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°

，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；

未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。

保温和拿取试管过程中应避免收到振动，造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。

按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。

λc=antilg（∑X/n）

式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。

反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；

n为每个浓度的平行管数。

当λc在0.5～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表1凝胶法干扰试验溶液的制备

编号ABCD

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释倍数

所含内毒素的浓度

平行管数

供试品无/溶液供试品2λ/溶液

—供试品溶液

—1248

—2λ1λ0.5λ0.25λ

2λ/检查用水

检查用水

1248

2λ1λ0.5λ0.25λ

检查用/无水

—

—

2444422222

注：

A为供试品溶液；

B为干扰试验系列；

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；

D为阴性照

只有当溶和阴性对照溶的所有平行管都为阴性，并且系列溶的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。

当系列浓的果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用若供试品溶液在小MV的释倍数下对试验有干扰应将供试品溶液进行不超MV的进一步稀释再复干扰试验

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、和、透析或加热处理等）排除干扰。

为确保所选择的处理方法能有效地排除扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供品溶液进行干扰试验

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素查法时，须进行干扰试验

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验

检查

凝胶限度试

按制备溶。

使用稀释倍数不超MV并且已经排干扰的供试品溶液来制备溶。

按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作

2凝胶限度试验溶液的制

编内毒素浓平行制内毒素的溶2A供试品溶液2

B

供试品溶液2λ/

C2λ/检查用水2

2

检查用水无D

注为供试品溶液为供试品阳性对照为阳性对照为阴性对照

结果判保6分分钟后观察结果。

若阴性对照溶的平行均为阴性，供试品阳性对照溶的平行管均为阳性，阳性对照溶的平管均为阳性，试验有效

若溶的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。

若溶的两平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。

若溶的两个平行管中的一管阳性，另一管为阴性，需进行复试。

复试时溶需支平行管，若所有行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定

若供试品的稀释倍数小MV而溶出现不符合规定时，需将供试稀释MV重新实验，再对结果进行判断

凝胶半定量试

本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。

按备溶。

结果判若阴性对照溶的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶的平行管均为阳性，系列溶的反应终点浓度的几何平均值0.2，试有效

系列溶中每一系列的终点稀释倍数乘，为每个系列的反应终点度。

如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓

若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。

每一列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓按公=antil∑c/。

若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度（如果检验的是稀释过的供试品则记为小乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。

若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。

当供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

表3凝胶半定量试验溶液的制备

编号ABC

内毒被素浓度/加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释倍数

所含内毒素的浓度

行管数

供无/试品溶液

检查用水

————

供2λ/试品溶液

1

2λ

检2λ/查用水

2λ1λ0.50.25λ

22

2222222

D注：

供试品溶液。

检查用水稀释至的稀释倍数不得超过B阳性对照）CD方法光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。

终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。

动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。

根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。

终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。

动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。

检/无查用水

—

—

并且通过干扰试验的A为不超过MVD从通过干扰试验的稀释倍数开始用倍，最后倍和841倍、2倍、。

MVD（供试品A为2λ浓度标准内毒素的溶液。

为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

为阴性对照。

2光度测定法

21℃37光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为±

℃。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照

所用仪器和试剂的有关说明进行。

为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。

用标准内毒素制成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10倍），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。

每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。

同时要求做照，当阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。

根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于试验方为有效。

否则须重新试验。

干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。

按表4制备溶液A、B、表4光度测定法干扰试验溶液的制备编号ABC

内毒素浓度

被加入内毒素的溶液

无

供试品溶液

标准曲线的中点（或附近点）的浓λ度（设为）m

个3至少

支阴性0.98平管至2至2每一

液。

为加入了标准曲线中点或靠近中点的一B个已知内毒素浓度的，且与溶液倍数的供试品溶液。

为如C的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

D为阴性对照。

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量当内毒素的回收率在在干扰作用。

当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。

当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

检查法使用系列溶液

浓度（最低一点设定为λ）

用水

浓度至少

检查用水

的供试品溶MVDA为稀释倍数不超过有相同稀释A项下描述“标准曲线的可靠性试验”。

，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）c和cst100%

×

-c）/λR=（cmts则认为在此试验条件下供试品溶液不存200%，50%～的每一个平行管的内毒素浓生成的标准曲线来计算溶液CA

至度。

试验必须符合以下三个条件方为有效：

⑴系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；

⑵用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；

⑶阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。

结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。

若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。

本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。