分子标记技术Word格式.docx

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2.2ISSR标记技术ISSR即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。

它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。

已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。

几个重要的名词：

ISSR：

他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

这类标记又被称为ASSR或AMP-PCR。

RAMP:

在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR引物,另一个是随机引物。

如果一个是5′端加锚的ASSR引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP技术。

ISSR分子标记的优点2实验成本低；

3操作简单；

4实验稳定性高；

5物种间通用；

6多态性较高；

1记录方便；

7精确度高；

8检测方便；

9开发费用低。

ISSR标记技术原理：

用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16～18个碱基序列,由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5′或3′末端结合,通过PCR反应扩增SSR之间的DNA片段。

SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR可以检测基因组许多位点的差异。

ISSR的应用举例

――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析PCR扩增及产物检测：

从所有引物中筛选出扩增条带晰、稳定性好、特异性强的引物对48个DNA样品进行PCR扩增。

引物筛选：

从100个ISSR引物中筛选出扩增产物条带清晰的13条引物。

遗传多样性分析：

筛选出的13条引物共产生104条清晰条带，其中多态性条带94条，多态百分率为90.38%，平均每个引物扩增条带数为8条。

结果显示，ISSR分子标记对攀枝花苏铁多样性的研究效果很好。

第三代分子标记技术章丽SNP的检测方法测序法酶切法荧光PCR法DNA芯片法质谱法分子标记技术的应用张文青丛峰遗传多样性（geneticdiversity）一般指品种间及品种内个体在DNA水平上的差异。

通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗传结构及遗传关系。

在经济动物育种过程中，可以准确地鉴定和筛选具有优良遗传变异的个体，这是育种工作的前提。

在水产动物中，由于海洋生物生活环境的特殊性，要弄清海洋生物的遗传结构及遗传边界相对来说比较困难。

但随着具有高多态性、分析过程快、位点丰富的DNA分子标记技术的出现，水产动物群体遗传学的分析变得简单快捷。

应用举例AFLP分析大黄鱼野生种群和养殖群体养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群，其遗传多样性水平较低，遗传变异贫乏。

2.RAPD技术对3个中国花鲈群体4个日本鲈鱼群体进行了遗传分化研究，结果进一步从分子水平上支持将中国产花鲈和日本的鲈鱼划分为2个种的观点，并且RAPD数据表明花鲈和鲈鱼群体内都出现了明显的遗传分化。

3.微卫星技术对东南亚海区鲈鱼进行分析，推翻了东亚地区只有1种鲈鱼的说法。

在现代动物育种中，由于要利用各种亲属的表型信息，准确地系谱记录是十分重要的。

在海洋生物育种中必须搞清楚亲子关系，这样才能利于根据亲属信息准确选留个体并能防止群体近交的发生。

利用DNA分子标记位点的多态性，以多个标记位点在一定群体中各等位基因的频率为基础，计算父子关系相对机会RCP来进行血缘鉴定和血缘控制。

应用举例1.微卫星标记分析表明4个微卫星标记可以鉴定95％的后裔，5个微卫星座位的累积排除率可以达到96％以上，所以微卫星标记可以应用于中国对虾的家系鉴定。

连锁图谱（linkagemap），又称遗传图谱（geneticmap）或遗传连锁图谱（geneticlinkagemap），是指基因或DNA分子标记在染色体上的相对位置。

构建遗传图谱的意义：

确定不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定等提供理论依据。

绘制遗传连锁图的方法有很多，但是DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。

早期使用的多态性标志有RFLP限制性酶切片段长度多态性、RAPD随机引物扩增多态性DNA、AFLP扩增片段长度多态性；

80年代后出现的有STR短串联重复序列，又称微卫星DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP单个核苷酸的多态性分析。

绘制遗传连锁图谱的目的是要揭示动物所携带遗传信息的内容，准确确定控制数量性状座位（QTL）在基因组中的位置。

借助与QTL连锁的分子标记，在育种中人们就能够对有关QTL的遗传进行追踪，提高对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。

大量的QTL已经被绘制出来并表现出了水产养殖种类的特性。

在虹鳟的研究中，高温耐受力、产卵时间以及胚胎发育的速度等这些QTL已经成功被绘制出来。

在罗非鱼中，以色列和美国的一个合作团队的科学家已经培育出了杂交罗非鱼亲本，以便研究其连锁图谱和进行QTL分析。

另外，一些有害等位基因和被破坏的性别比例、控制特色和性别决定的QTL，已经控制大量与先天免疫有关的生物化学参数的QTL也已经在罗非鱼中得到了确定。

这些都是分子标记技术在绘制遗传图谱及QTL定位中的运用。

分子标记辅助选择（MarkerAssistedSelection，缩写为MAS）是将分子标记应用于生物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段。

长期以来，植物育种都是依植株的表型性状进行选择的。

DNA标记的出现使植物育种从表型选择过渡到分子育种的新阶段。

其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。

常规育种过程中需通过大量的基因重组、筛选过程，还掺杂有筛选遗漏问题。

其周期长，工作量大。

而利用分子标记辅助选择技术大大减少了其连锁累赘现象，增加了目标性，在回交低世代即可找到其目标材料。

目前看来，分子标记辅助育种技术还不成熟、不完善。

利用分子标记辅助选择技术能作为一种快速、准确、有效的选择手段。

但是，分子标记辅助育种技术只有与常规育种相结合，才能更快地并且定向地同步改良农作物的产量、品质、抗逆性。

因此，利用分子标记辅助选择技术得到的优异种质仍要通过常规育种方法选择培育，才可真正用到育种中去，尽快在生产上产生经济效益。

总之，分子标记辅助育种的优越性只有通过常规育种才可表现出来。

基因组DNA的提取引物筛选遗传多样性分析引物最新的分子标记技术1.RGAs标记ResistanceGeneAnalogs,抗病基因类似物2.3.4.1.什么是SNP?

2.SNP的分类3.SNP的检测方法SNPSNP:

Singlenucleotidepolymorphism个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异替换、插入或缺失所引起的多态性。

SNP基因编码区SNPs（cSNPs）基因周边SNPs（pSNPs）基因间SNPs（iSNPs）同义cSNPsynonymouscSNP非同义cSNPnon-synonymouscSNP2.SNP的分类针对目标SNP位点，直接设计合适引物扩增得到含突变位点的PCR产物，经序列测定得到位点信息，属SNP分析的金标准。

SNP-HRM（HighResolutionMelt）熔解曲线分析技术检测技术原理：

在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。

荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。

纯合子的扩增曲线杂合子的扩增曲线EST1.什么是EST2.EST的技术路线3.EST的应用4.EST的测序及分析过程ESTEST表达序列标签,ExpressedSquencetags是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20到7000bp不等,平均长度为360±

120bp。

EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

上个世界90年代GraigVenter提出了EST的概念，并进行了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模测序的时代的开始（Adamsetal..1991）AAAAAAAAAAAAmRNAPrimer/Reversetranscriptase获取EST的技术路线5’staggeredlengthcDNAsduetopolymeraseprocessivityCloningandsequencingcDNAs3’EST5’ESTAnoverviewofhowESTsaregeneratedESTsaregeneratedbysequencingcDNA,whichitselfissynthesizedfromthemRNAmoleculesinacell.ThemRNAsinacellarecopiesofthegenesthatarebeingexpressed.mRNAdoesnotcontainsequencesfromtheregionsbetweengenes,norfromthenon-codingintronsthatarepresentwithinmanyinterestingpartsofthegenome.◆基因表达系列分析SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE

?

基因表达系列分析是一种用于定量，高通量基因表达分析的实验方法Velculescuetal.,1995。

SAGE的原理就是分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应的基因的表达丰度。

◆?

DNA微阵列或基因芯片的研究

高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。

在许多情况下，cDNA芯片的探针来源于3'

EST?

Dugganetal.,1999，所以EST序列的分析有助于芯片探针的设计。

AAAAAATTTTTTAAAAAATTTTTTAAAAAATTTTTTGTACAAAAAATTTTTTGTACAAAAAATTTTTTGTACCATGAAAAAATTTTTTGTACACATGAAAAAATTTTTTGTACBCATGGTACACATGGTACBCATGCATGGTACAGTACBABABCATGGTACCATGGTACGTACCATGCATGCATGSage图解基因芯片或微阵列技术流程4大应用领域一、遗传多样性的分析二、亲缘关系的研究三、遗传连锁图谱的构建四、分子标记辅助选育**什么是遗传标记？

遗传标记geneticmarker:

指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。

它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；

因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。

遗传标记的类型形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记cytologicalmarker生化标记biochemicalmarker分子标记molecularmarker：

DNA分子遗传标记，或DNA标记。

形态学标记形态标记即个体的外部形态特征。

形态标记简单直观、经济方便；

但其数量在多数有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。

此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。

主要在早期使用。

细胞遗传标记细胞学标记即植物细胞染色体的变异。

包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。

与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。

细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；

同时某些物种对染色体变异反应敏感；

还有些变异难以用细胞学方法进行检测。

生化标记生化标记包括同工酶和等位酶标记。

（以酶作为标记）同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。

分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。

生化标记具两个方面的优点：

一是表现近中性，对生物经济性状一般没有大的不良影响；

二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。

生化标记的应用有限：

一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。

分子标记分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。

分子标记的优越性表现为：

（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受<

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季节<

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、环境限制，不存在表达与否等问题；

（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；

（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；

（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；

（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。

分子标记的三个阶段随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分子标记。

第一代分子标记：

RFLP;

RAPD;

AFLP；

mtDNA分子标记第二代分子标记：

微卫星（ms）微卫星DNA；

ISSR第三代分子标记：

SNP单核苷酸多态性；

EST目前的分子标记类型目前的分子标记有三类：

第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNAFingerprinting）、原位杂交（insituhybridization）等；

第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simplesequencelengthpolymorphism,简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记AFLP、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；

第三类是一些新型的分子标记，如：

SNP标记、表达序列标签EST标记等。

1、RFLP基本原理：

特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段。

限制性内切酶识别DNA中特殊的核苷酸序列不同个体中的酶切位点不同，所以，种群具有限制性片段多态性。

用特异性的限制性内切酶进行酶切，得到不同长度的DNA片段，这些片段在跑电泳中会分离。

限制性片段长度多态性通常被人们用来标记目的基因。

特点：

（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；

（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；

（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；

（4）结果稳定、可靠；

（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。

2、RAPD基本原理：

用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。

RAPD标记的特点有：

（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；

（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；

（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；

（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；

（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。

3、AFLP基本原理：

AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。

AFLP标记的特点有：

（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；

（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；

（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；

（4）分辩率高，结果可靠；

（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。

。

此外，在RAPD和RFLP技术基础上建立了SCARSequencecharacterizedamplifiedregions，序列特异性扩增区域，CPASCleavedpolymorphicamplifiedsequence，酶切扩增多态序列和DAFDNAamplifiedfingerprints，DNA扩增指纹等标记技术。

这些技术的出现，进一步丰富和完善了第一代分子标记，增加了DNA多态性的研究手段。

SSR标记技术的基本原理　鹅掌楸基因组DNA的提取　引物筛选　物种特异性扩增引物特异性验证随机选取鹅掌、楸北美鹅掌楸各四个样本176对引物PCR扩增挑选选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物引物8对用鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌楸各30个基因型再次筛选一对特异性引物筛选的一对引物鹅掌楸基因北美鹅掌楸基因190bp180bp特异性扩增鹅掌楸杂交鹅掌楸北美鹅掌楸190bp190bp和180bp180bp与一对引物特异性扩增**