项目二十二 变态反应的检验技术汇总文档格式.docx

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支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性胃炎、荨麻疹、过敏性休克等。

Ⅰ型变态反应发生迅速，临床常见的严重病例是青霉素引起的过敏性休克，如不及时抢救患者会很快死亡。

但型变态反应一般不引起组织损伤，所以刺激因素解除后康复也快。

　　Ⅰ型变态反应的检验有多种方法：

①皮肤试验，例如青霉素皮试；

②激发试验，例如支气管激发试验；

③血清IgE测定。

Ⅰ型变态反应的临床诊断并不困难，实验室检查的主要目是明确过敏原，以采取适当的回避措施，或者必要时进行特异性脱敏治疗。

（二）Ⅱ型变态反应

　　Ⅱ型变态反应涉及的抗原比较复杂，药物、病毒或自身抗原都可成为变应原，刺激机体产生IgG或IgM类抗体，抗体可特异性地结合到位于细胞表面的抗原上，活化补体、溶解靶细胞、诱导粒细胞浸润及吞噬作用。

涉及的疾病有新生儿溶血症、自身免疫性血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、部分肾小球肾炎、肺出血－肾炎综合征等。

　　少数情况下，某些抗体与靶细胞结合可刺激靶细胞兴奋，导致非常特殊的效果。

例如抗体促甲状腺素受体的抗体可使甲状腺细胞过度分泌甲状腺素而引起甲状腺功能亢进；

有些抗体诱导ADCC作用引起慢性淋巴细胞性甲状腺素等。

这两型特殊的Ⅱ型变态反应曾被命名为Ⅴ型和Ⅵ型变态反应。

　　Ⅱ型变态反应的检验主要是针对引起反应的特异性抗体；

但Ⅱ型变态反应主要涉及血液系统疾病和自身免疫病，有关内容参见血液学检验教材和本书第二十五章。

　　（三）Ⅲ型变态反应

　　Ⅲ型变态反应的抗原多是蛋白质分子，刺激机体产生大量IgG和IgM类循环抗体，抗原与抗体结合形成的免疫复合物（immunecomplex，IC）在一定条件下可沉淀于局部组织，激活补体引起炎症反应。

涉及的疾病有血清病、结缔细胞病及局部Arthus反应等。

　　Ⅲ型变态反应的检验主要是检测循环免疫复合物或组织固定的免疫复合物；

还可进一步检测免疫复合物中的抗体特异性；

有时候也可用皮肤试验进行测定。

　　（四）Ⅳ型变态反应

　　Ⅳ型变态反应是细胞免疫介导的炎症，没有抗体和补体参与，发生较为缓慢，所以又称为迟发型超敏反应（DTH）。

涉及的疾病有接触性皮炎、结核病、移植排斥性反应等。

Ⅳ型变态反应的检验可从多方面进行。

要以用促有丝分裂原或结核菌素检测T细胞的敏感状态；

也可用抗原检测机体的特异性致敏状态；

还可通过检测细胞因子或者皮肤试验的办法进行检验。

二动物实验性过敏反应

豚鼠过敏反应

（Anaphylactichypersensitivityofguinea-pig）

【实验原理】

　　豚鼠过敏反应属于Ⅰ型变态反应。

先给动物注射小剂量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物处于致敏状态。

当第二次用较大剂量的相同抗原注射时，即激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒释放多种生物活性介质，使动物迅速产生严重的过敏反应及至过敏性休克或死亡。

　　【试剂和器材】

　　1．动物　体重200g左右的健康豚鼠。

　　2．马血清、鸡蛋清。

　　3．无菌注射器、针头、酒精棉球等。

　　【步骤和方法】

　　1．取豚鼠2只，经腹腔或皮下注射10%马血清（用生理盐水稀释）0.1ml。

　　2．2~3周后，在上述2只豚鼠心脏内注射，一只注射马血清原液（不稀释），另一只注射鸡蛋清，各2ml。

　　3．注射后数分钟内密切观察其反应现象。

　【结果判定】

　　注射马血清的豚鼠出现烦躁不安、抓鼻、耸毛、咳嗽、打喷嚏、气急、呼吸困难、痉挛性跳跃、大小便失禁、站立不稳等现象，重者在数分钟内死亡。

将死亡豚鼠解剖，可见肺脏极度气肿，胀满整个胸腔。

由于动物个体反应性不同，有的反应较轻，可幸免死亡。

如果再注射马血清也不出现反应，此称为脱敏状态。

但脱敏状态是暂时的，大约2周后又处于致敏状态。

　　注射鸡蛋清的豚鼠不出现任何反应。

　　【注意事项】

　　心脏内注射时，要固定好动物，以免划破心脏；

当见到注射器内有回血时再注入抗原。

　　【方法评价】

　　豚鼠过敏试验是一个经典的动物过敏性休克试验，方法简单、重复性较好、稳定、过敏现象明显。

　　【临床意义】

　　豚鼠过敏反应现象与人类过敏性休克反应相似。

通过试验加深学生对Ⅰ型变态反应现象及发病机理的理解，提高对人类过敏反应防治重要性的认识。

另外，也可用于抗过敏药物的筛选。

　　【思考题】

　　1．上述试验的两只豚鼠为什么会出现完全不同的反应现象？

　　2．Ⅰ型变态反应是如何发生的？

四血清总IgE的测定——ELISA双抗体夹心法

（TotalserumIgEassay）

【实验原理】

　　将特异性羊抗人IgE抗体包被固相载体，然后与待检血清中IgE结合，洗涤后再加入酶标羊抗人IgE抗体，经洗涤，加底物显色，其吸光度值与样品中IgE含量成正比。

待检血清IgE的含量可从标准IgE测定制作的标准曲线上查得。

　　1．标本　待检血清

　　2．羊抗人IgE纯化抗体（包被用）。

　　3．羊抗人IgE-HRP用方阵滴定法确定最适浓度。

　　4．IgE标准参考品　混合人血清，经WHO国际IgE标准参考品标定IgE含量。

5．底物缓冲液　取0.1mol/LNa2HPO4·

12H2O（35.8g/L）5.14ml、0.05mol/L柠檬酸（10.5g/L）4.86ml，混匀，加入邻苯二胺（OPD）4mg，置棕色小瓶中，临用时加30%H2O24.0μl，混匀。

　　6．包被液　pH9.50.05mol/LCB（Na2CO31.59g、NaHCO32.93g、NaN30.2g，加蒸馏水至1000ml）。

　　7．稀释液　pH7.40.02mol/LTris-HCl缓冲液（Tris2.42g、1mol/LHCl13ml，加蒸馏水至1000ml）。

　8．洗涤液　含0.1%Tween-20的pH7.40.02mol/LTris-HCl缓冲液。

9．终止液　2mol/LH2SO4。

　10．器材　温箱（或水浴箱）、酶标测定仪、酶标反应板、微量加样器、小吸头等。

　　1．包被　将羊抗人IgE纯化抗体用包被液稀释成10μg/ml，加到酶标反应板各孔中，每孔200μl，加盖放4℃24h。

次日用洗涤液洗涤3次，每次3min（下同）。

甩干。

　　2．加样　A排孔依次加入连续倍比稀释的IgE标准参考品200μl（浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05IU/ml）。

B排孔依次加入1:

10、1:

100的待检血清200μl，各设两个复孔。

同时设阴性、阳性血清对照，各加200μl；

空白对照加入稀释液200μl。

加盖置37℃2h。

洗涤，甩干。

　　3．加酶标抗体每孔加已稀释的羊抗人IgE-HRP200μl，加盖置37℃2h。

　　4．加底物　每孔加底物液200μl，置37℃暗处20min。

　　5．终止反应每孔加终止液50μl。

6．测定结果测定各孔A492值。

图4-1IgE标准曲线

【结果判定】

以标准参考品IgE含量（IU/ml）为横对数坐标，以各浓度的A值为纵算术坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线（图4-1）。

由标准曲线查出样品中IgE的相对含量，再乘以稀释倍数，即为样品中IgE的含量。

IgE1IU=2.4ng

参考值范围：

　　男　631±

128IU/ml（31~5535ng/ml）

女337±

60IU/ml（31~2000ng/ml）

【注意事项】

　　1．本法的灵敏度为0.2IU/ml，最敏感且呈线性关系的范围是3.13~50IU/ml，如所测结果不在此范围内，可增减浓度后再行测定，以求得准确结果。

　　2．包被用羊抗人IgE抗体、待检血清稀释度、羊抗人IgE-HRP浓度及温育时间均可影响本法结果，故需选择其最适条件。

　　3．其它注意事项参见ELISA间接法。

　　ELISA双抗体夹心法测血清IgE简便、快速，特异性强，敏感性高于血凝法，是检测抗原最常用的方法。

　血清IgE水平升高常与过敏性疾病和寄生虫感染等疾病有关，可见于过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、寄生虫感染、支气管肺曲菌病、IgE骨髓瘤、急性或慢性肝炎、SLE、类风湿关节炎等疾病。

血清IgE降低可见于低丙球蛋白血症、IgE以外的骨髓瘤、恶性淋巴细胞性白血病、免疫缺陷病等。

　　1．ELISA双抗体夹心法测定血清IgE时应注意哪些问题?

2．测定血清总IgE有何临床意义?

五　循环免疫复合物的测定

（Detectionofcirculatingimmunecomplex）

（一）PEG比浊法

　　不同浓度的聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG，常用PEG6000）能选择性地沉淀不同的蛋白质。

当其终浓度为30~40g/L时，能选择性地沉淀循环免疫复合物（circulatingimmunecomplex,CIC）。

然后用分光光度计测定其吸光度，即可反映沉淀物的相对含量。

　1．标本待检血清

2．pH8.40.1mol/L硼酸盐缓冲液（BBS）称取硼砂（Na2B4O7·

10H2O）0.429g、硼酸（H3BO3）0.340g，溶于100ml蒸馏水中。

　　3．41g/LPEG溶液　取4.1gPEG、10gNaF溶于100mlpH8.40.1mol/LBBS中。

　　4．器材　分光光度计、离心机、试管、吸管等。

　　1．待检血清用pH8.40.1mol/LBBS作1:

3稀释（0.2ml血清+0.4mlBBS）。

　2．按表4-1加样，此时PEG最终浓度为37.3g/L。

表4-1PEG比浊法测CIC方法

测定管

对照管

稀释血清（ml）

0.2

41g/LPEG（ml）

2.0

—

PH8.4BBS（ml）

3．按上表加好后混匀，置4℃冰箱1h后取出，置室温10~15min。

　　4．用分光光度计测定，以BBS调零，测两管A495值。

　　5．同法测定不同浓度AHG（聚合人IgG）A495值，制作标准曲线。

　　【结果判定】

　　待检血清A值=测定管A值-对照管A值

正常血清CIC的A值为0.043±

0.020（X±

SD）

由标准曲线查出待检血清中CIC的含量（相当于AHG），再乘以稀释倍数，即为样品中CIC的含量。

　　1．不同浓度PEG可沉淀不同分子量的免疫复合物。

20g/LPEG能沉淀较大的CIC、40g/LPEG则沉淀较小的CIC，但浓度大于50g/L时PEG选择性沉淀CIC的特性即行消失，可能导致假阳性结果。

　2．4℃时CIC沉淀最佳，室温每升高1℃，A值下降0.2。

因此应注意温度变化对结果的影响。

　　3．低密度脂蛋白、高γ球蛋白血症或脂肪含量过高可引起浊度增加，故应空腹采血。

　　4．标本陈旧或反复冻融等均可影响检测效果，故受检血清一定要新鲜。

4℃保存不能超过3天，-20℃保存有效期可适当延长。

　此法快速、简便、敏感度AHG达20μg/ml，但不能反映小分子免疫复合物的情况，重复性差，一般可用作CIC的筛选。

　　CIC检测方法较多，原理各不相同，结果也不尽一致，最好采用多种方法同时进行，以提高阳性检出率。

【临床意义】

　　1．对免疫复合物疾病有辅助诊断价值，如血清病、SLE、慢性活动性肝炎时CIC往往升高。

　2．对CIC的动态观测有助于监测某些疾病的发展，协助判断疗效和预后。

　3．有助于探讨研究Ⅲ型超敏反应病的发病机理。

　　【附】聚合人类γ-球蛋白（AHG）的制备

1．将粗制人IgG6.5mg溶于1mlPBS（PH7.4）中，置63℃作用20min。

　　2．取出，4℃10000r/min离心30min，吸取上清液，分装，-70℃保存。

　　3．如需制作标准曲线，将上清液置于冰浴中融化，2000r/min离心15min，用Lowry蛋白测定法定量测定AHG的浓度。

在应用标准曲线之前应将制备的AHG制剂同WHO标准试剂进行比较。

（二）抗补体法

　　【试验原理】

　　血清中有CIC存在时，可与本身C1结合，当将此待检血清56℃加热1h，能破坏结合的C1，空出补体结合点。

在加入豚鼠血清（补体）时便可与之结合，致使后加入的致敏红细胞不发生溶血或溶血程度减弱。

　　1．标本　待检血清。

　　2．补体　经补体滴定，求出其5CH50时的最适稀释度，以此稀释度稀释补体。

（滴定方法见补体结合试验）。

　3．热聚合IgG制备见PEG比浊法。

　　4．试剂　pH7.3~7.4工作BBD、2.8%溶血素致敏SRBC（制备方法见补体结合试验）。

　　5．器材　冰箱、离心机、分光光度计、水浴箱、1ml吸管、试管等。

　　1．将待检血清56℃灭活60min，按表4-2操作。

表4-2抗补体法试验

空白对照管

冷工作BBD（ml）

0.4

待检血清（ml）

补体（ml）

混匀，4℃作用60min。

2.8%致敏血球（ml）

混匀，置37℃水浴作用15min

2．然后各加入3.0ml工作BBD，2500r/min离心5min，取上清，以工作BBD调零，测两管A541值。

　　测定管A值比空白对照管A值小50%为阳性。

若定量测定，将待检血清和AHG分别作系列稀释，按上表操作，分别确定待检血清CH50时的稀释度及AHGCH50时的含量。

以下式计算血清中CIC的含量。

　　CIC含量/ml=CH50时AHG含量/ml×

待检血清CH50时的稀释倍数。

　　1．待检血清需加热灭活后再测定，以破坏结合的C1，空出补体结合点，并破坏其中的补体。

但需避免产生热变性蛋白质而造成人为假阳性。

故需严格控制加热的温度和时间。

　　2．豚鼠血清易受温度影响而失活，应分装冻存于-20℃，一周内使用，过期作废。

最好-70℃保存。

切忌反复冻融。

　　3．补体在实验前必须经过认真滴定，不然补体用量过大会出现假阴性，用量过小会出现假阳性。

　　4．工作BBD、致敏SRBC均应新鲜配制。

　　5．待检血清要新鲜，抽血后即行分离，应防止细菌污染、溶血。

如不在当日检测应-20℃冻存。

　　6．本法只能检出能与补体结合的CIC，抗补体的任何因素均能干扰本试验。

【方法评价】

　　此法简便、灵敏度高，易在一般实验室进行。

　【临床意义】

　　同CIC测定的PEG比浊法。

　【附】CH50溶血标准管的制备

　　取1ml2.8%SRBC悬液，加7ml蒸馏水，使SRBC完全溶解，再加入2.0ml贮存BBD（见补体结合试验）。

取上述溶液0.5ml加入0.28%SRBC（用工作BBD将2.8%SRBC稀释10倍即可）0.5ml、工作BBD3.0ml，离心后测A541值，即为CH50标准值。

　【思考题】

　　1．抗补体法测CIC，待检血清为什么需加热灭活？

　　2．CIC的测定方法主要有哪些种类？

各有什么特点？

六类风湿因子的测定——玻片胶乳凝集试验

（Rheumatoidfactorassay—latexslideagglutination）

类风湿因子（RF）是一组IgM类为主的抗变性IgG的自身抗体，它能与人或动物的变性IgG结合，而不与正常人IgG发生反应。

用聚苯乙烯胶乳颗粒吸附人类变性IgG，成为致敏胶乳颗粒，然后检测血清中的RF，据此有助于类风湿性关节炎（RA）的临床诊断。

本处只介绍玻片法。

　【试剂和器材】

　1．标本　待检血清、阳性血清、阴性血清。

　2．胶乳抗原人变性IgG致敏的胶乳试剂。

　　3．pH8.20.1mol/L甘氨酸缓冲盐水　取甘氨酸0.75g、NaCl0.85g加蒸馏水至100ml，再加1mol/LNaOH0.2~0.3ml，调至pH8.2。

　　4．器材　黑色方格反应板、滴管、牙签等。

　【步骤和方法】

　　1．将待检血清、阳性血清、阴性血清经56℃30min灭活，用pH8.20.1mol/L甘氨酸缓冲盐水作1:

20稀释，备用。

　　2．在黑色方格反应板上依次分别加入稀释的待检血清、阳性血清、阴性血清各1滴（约50μl），然后每格加入胶乳抗原各1滴（约50μl）。

　　3．用牙签分别充分混匀，2~3min后观察结果。

　　1．如出现凝集颗粒且液体澄清者为阳性，即RF阳性；

如仍保持均匀胶乳状为阴性反应，即RF阴性。

　　2．若先在试管中将待检血清作倍比稀释，然后分别加在玻片上作上述试验，可作半定量测定。

　　1．试剂应保存在4℃，切勿冻存。

使用前应使试剂接近室温并摇匀。

　　2．测定时需同时作阴性、阳性对照，观察时应注意排除非特异性凝集。

　　3．所加液滴大小应一致。

　　4．假阴性的出现：

（1）存在非IgM类抗IgG抗体，其凝集效价较IgM类RF差，很可能被忽视。

（2）IgM类RF与内源性IgG结合，形成可溶性免疫复合物，如它们亲合力高，二者仍保持结合状态。

　　此法操作简便，结果清晰容易判断，敏感性高于血凝试验，但特异性低于血凝试验。

主要用于检测IgM类RF，对于其它Ig类RF不能检出。

　　RA时RF的阳性检出率为60~90%，当RA持续存在时阳性率增高,类风湿结节病人阳性率可达100%。

但是RF检测不是诊断RA的特异性试验，许多疾病及少数正常人（尤其老年人）也存在RF，应注意鉴别诊断。

　　1．RF阳性有何临床意义？

　　2．用此法检测RF如何排除假阳性、假阴性的影响？

七　皮肤试验

　　皮肤试验（skintest）简称皮试，是在皮肤的体内免疫学试验。

当试验抗原进入致敏者皮肤时，皮肤中结合有IgE的肥大细胞或致敏T细胞就会与试验抗原结合，引发即刻型或迟发型的皮肤超敏反应。

试验抗原也可从注射部位进入微血管，与循环中的相应抗体结合，形成的免疫复合物可在局部沉积，激活补体引起炎症。

所以皮肤试验主要用于检测型和型变态反应，有时也用于检测Ⅲ型变态反应。

　　一、试验准备

　　首先应当制备试验用抗原，如有合格商品可直接购买。

可以作为变应原的物质种类繁多，例如动物皮毛、家禽羽毛、鸽粪、昆虫、螨类、真菌、花粉、杂草、物理粉尘和各种食品等都可能成为变应原。

　　不同抗原的制备方法不同，但一般包括以下几个步骤：

①收集原料；

②粉碎与匀浆；

③脱脂与提取；

④过滤与分离；

⑤分装保存。

分装保存之前应对提取产物进行鉴定。

首先必须经过无菌试验、急性毒性试验和热原检查，保证提取产物无明显的毒副作用；

还要测定产物的蛋白含量，用凯氏定氮法或磷钨酸沉淀法标定出总氮单位或蛋白氮单位。

　　变应原的范围很广，难以做得完全，所以查找变应原需依靠患者的病史和医师的经验以将可疑范围缩小,学样成功的机会就大得多。

一般医院和卫生所都能做药物过敏试验，多在注射室完成；

防疫部位在一些免疫接种之前有时也要做皮肤试敏；

其余的均在变态反应科或检验科的专门实验室。

实验室应有专人负责，除具备各种专用试验器材之外，还应备有意外抢救的药品及设施。

　　试验部位应清洗干净，严格消毒，以免皮肤的不洁物引起非特异性反应或感染。

当皮肤患湿疹、感染、皮炎或外伤时不宜进行皮肤试验。

正在或近日服用免疫抑制剂或抗组胺药物者也不宜进行皮肤试验。

　　二、试验类型及方法

　　皮肤试验的最常用部位是前臂曲侧，因此处皮肤较为光滑细腻，而且便于试验操作和结果观察。

按正规作法，左右两臂一侧作试验，另一侧作对照。

需要时也可选用上臂或背部皮肤。

具体试验方法可分为皮内试验（intracutaneoustest）、挑刺试验（pricktest）和斑贴试验（patchtest）。

　　1．皮内试验将试验抗原与对照液各0.0～20.03ml用皮试针头分别注入皮内（不是皮下），使局部产生一个圆形小丘。

当同时试验多种抗原时，相互间至少间隔4cm，以免强烈反应时互相混淆结果。

　　皮内试验的敏感性比其他皮肤试验高，所用抗原应适当稀释，以免出现严重反应；

当高可疑性抗原出现阴性结果时，应逐渐加大抗原浓度进行重复试验。

　　皮内试验是最常用的皮肤试验，应用范围也很广，几乎各类抗原及各型反应都可用皮内试验进行测定，只是不同类型的反应观察结果的时间和判定结果的标准不所不同。

　　2．挑刺试验也称点刺试验或刺痕试验。

将试验抗原与对照液分别滴于试验部位皮肤上，用针尖透过液滴或在皮肤上轻轻地挑刺一下，以刺破皮肤但以不出血为度；

1min后拭（吸）去抗原溶液。

同时试验多肿抗原时，千万注意不要将不同的抗原液交叉混合，以免出现假阳性。

　　挑刺试验主要用于型变态反应，该法虽比皮内试验法敏感性稍低，但假阳性较少，与临床及其他试验的相关性较强。

　　划痕试验（scratchtest）是挑刺试验的一个变型，用三棱针或注射器针头在皮肤划一条或多条约1cm长的创痕。

因为划痕的轻重与长短难于掌握一致，故不常用。

　　3．斑贴试验将试验抗原直接贴敷于皮肤表面的方法。

试验抗原为软膏时可直接涂沫在皮肤上；

如为固体物时可用蒸馏水混合或浸湿后涂敷于皮肤上；

如为水溶液则浸湿纱布后敷贴于皮肤上。

所用抗原浓度以不刺激皮肤为原则，涂敷范围以0.5～1cm为宜。

涂敷后盖以油纸或玻璃纸，用纱布或绷带固定；

如有明显不适感可随时打开查看，并进行适当处理。

　　斑贴试验主要是检测Ⅳ型变态反应，敏感程度虽然不太高，但假阳性较少，结果的可信度大。