小鼠成纤维细胞原代培养文档格式.docx

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当原代培养成功后，培养的细胞通过增殖达到一定数量后，必需对细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种于新的培养瓶中，这一过程即为传代培养，亦称为继代培养或连续培养。

如果原代细胞是正常细胞，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，形成的单层细胞汇合，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；

另外，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，加之代谢物积累也不利于细胞生长或发生中毒。

此时，就需要将将培养细胞从原培养器中取出，加以分离，以1∶2或1∶3以上比率转移到另外培养器皿（瓶）内扩大培养，此过程称为传代（passage）。

原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。

细胞传代后一般经三个阶段：

游离期；

指数增生期和停止期。

培养细胞的“一代”是指传代培养的累积次数，其与细胞世代或倍增不同，细胞转移扩大培养的1代中，细胞约能倍增3～6次。

细胞增殖的旺盛程度通常用细胞分裂指数表示，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3d时分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期（对数生长期），适宜进行各种试验。

　　体外培养细胞和生长类型不同，传代培养的方法也不同。

贴附型生长的细胞要先进行消化，制成细胞悬液再传代；

而悬浮型生长的细胞可直接传代，或离心后传代。

3．细胞活力测定：

在标准化培养和实验条件下，细胞数目及活力测定极其重要。

1983年Mosmann首次应用MTT比色法检测培养细胞活力。

MTT的化学名称为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。

其具有接受氢原子而发生显色反应。

检测原理为，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢，脱下的H＋通过受氢体传递，能使外源性染料MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中。

细胞中的蓝紫色结晶物可以溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并表现为一定的色度。

用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，并根据光吸收值的高低判断活细胞数量。

在一定细胞数范围内，光吸收值与活细胞数成正比。

死细胞内酶失去活性，故无此功能。

该检测方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济安全，具有良好的相关性。

广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

三.实验物品

1．材料：

乳鼠、、HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。

2．器材：

超净工作台、解剖器材、酒精灯、离心管、移液管、吸管、烧杯、大平皿、96孔培养板、不锈钢滤网（100目、200目）、水浴箱、血细胞计数板、培养瓶、CO2培养箱、离心机、盖玻片，擦镜纸，香柏油、倒置相差显微镜、显微镜、全自动酶标仪（bio-rad550型）。

3．试剂：

（1）75％乙醇

（2）PBS液（pH7.2）配方：

　　　Nacl8g、Kcl0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g　　调pH7.4　定容1L

（3）无钙、镁离子PBS液

（4）D-HanK液（无钙、镁离子的HanK液）

（5）消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）

（6）0.25％胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶0.25g、D-Hanks液100ml,pH7.4）

（7）0.4%台盼蓝、

（8）培养液：

EMEM培养液（Eagle’sMinimumEssentialMediumEagle氏最低要求培养基）：

EMEM85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100ng/ml。

EMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除茵。

4℃冰箱贮存。

DMEM（Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium）：

RPMI1640培养液（90%RPMI1640、10%胎牛血清、双抗（青霉素,链霉素）100单位/ml

7.4%NaHCO3调pH至6.8～7.0）

RPMI1640维持液（5%胎牛血清、余同上）

（9）0.5%MTT溶液（5mg/ml）、

MTT0.5g，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存两周内有效。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

最好现用现配。

（10）二甲基亚砜

（11）碘伏

四.实验步骤

原代培养

组织块培养法:

1．动物处死　取新生大鼠（出生2～3天）一只，用颈椎脱臼法处死；

为避免过多血细胞的干扰，也可采用剪断颈动脉放血的方法处死。

然后，把新生大鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中2-3秒，取出后放在大平皿中携入超净工作台。

2．取材　用碘酒和75％乙醇再次消毒一次，打开消毒器械包用镊子新生大鼠腹部皮肤,用解剖剪开腹腔,充分暴露腹腔；

用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏（右肾略低）；

取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中。

（或取出肝组织置于培养皿中。

）

3．剪切　剪开肾膜，剥向肾门，去除肾膜及脂肪；

用吸管吸取灭菌PBS（或Hanks液）将肾脏清洗3次，去除血污；

将肾脏移入另一平皿中，沿纵轴剪开肾脏，剪去肾盂，用眼科剪将肾组织反复剪碎，直到剪成0.5～1mm3组织块；

用吸管加2～3滴培养液轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。

（或肝组织用Hanks液反复冲洗，以除去血细胞，将肝组织移入另一个培养皿中，用吸管吸取0.5ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成0.5～1mm3组织块。

4．接种：

用弯头吸管小心分次吸取组织块，使组织块吸在吸管端部，要避免吸得过高，组织块粘附于吸管壁而丢失。

将组织块均匀排布在培养瓶底部，控制组织块间距在0.5cm左右，每

25ml培养瓶底可摆布15～20块。

轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，翻瓶时勿使组织块流动，加入2～3ml培养液（液层厚约15mm），塞好瓶塞，置CO2培养箱37℃培养2～3h,（勿超过4h）。

此时组织块略干燥，能贴附于瓶壁上。

5.培养：

慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡附于瓶底的组织块，置培养箱中静止培养。

操作过程中动作一定要轻，减少振动，使培养液慢慢覆盖组织块，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。

6．观察　24小时后取出观察，移动培养瓶时要尽量使培养液震荡撞击组织块。

在显微镜下观察已贴壁的组织块有无细胞长出。

消化培养法:

1．处死动物、取材及剪切：

与组织块培养法相同。

剪切后的组织块再用灭菌的PBS（或Hanks液）清洗数次，直到PBS澄清为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉到管底，弃上清。

2．消化及分散组织块　按组织块体积5～10倍量，吸取0.25％胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液加到含组织块的无菌离心管中，与组织块混匀后，加盖无菌塞子密封，置37℃水浴中消化10～20min，其间每5min摇动一次，使组织块散开并与消化液充分接触。

当组织块变得疏松、颜色略白时，从水浴中取出离心管，在超净工作台内静置后吸去含胰蛋白酶的上清（此步骤可以在800～1000rpm离心3～5min去除含胰蛋白酶的上清），加入2～3ml培养液，终止消化。

用吸管反复吹打，直到大部分组织块分散成单细胞或细胞团状态为止。

最后将此细胞悬液用100目、200目的不锈钢滤网过滤至烧杯中。

3计数及稀释：

从过滤的细胞悬液中取1ml，用血细胞计数板计数。

根据计数结果，用培养液稀释，稀释后的细胞密度以5×

105～1×

106为宜。

4．接种培养：

将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，一般25ml小方瓶分装4～5ml,青霉素瓶分装1ml。

培养瓶上做好标记，培养瓶盖旋紧后再松半个螺旋，置CO2培养箱在37℃培养。

5．观察：

接种培养后要每日观察培养液是否污染、颜色变化及细胞生长状况。

培养液黄色且混浊表示污染，紫红色表明细胞生长不良，桔红色表明细胞生长良好。

传代培养

贴壁细胞的传代培养:

1．准备　从培养箱中取出原代培养细胞，在显微镜下观察，确认已长成致密单层、生长良好，适宜传代培养。

将培养瓶连同所需实验用品备齐，放入超净工作台内，所有实验操作均在超净工作台内进行。

2.消化　弃去原代培养瓶内的旧培养液，加入适量无钙、镁离子PBS液（或Hanks液），轻轻摇动培养瓶，清洗残留在细胞表面培养液和碎片，弃去清洗液。

在培养瓶内加入消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA各1份）约2～3ml,以液面盖满细胞为宜。

培养瓶置室温或培养箱内2～3min后，在倒置显微镜下观察培养瓶中的细胞，当发现细胞胞质回缩、细胞间间隙增大时，或翻转培养瓶肉眼观察，细胞单层出现针孔大小的缝隙，则快速弃去消化液；

如未出现缝隙，则继续消化，直到出现缝隙。

向培养瓶中加入PBS液（或Hanks液），轻转培养瓶清洗残留的消化液后倒掉PBS液（或Hanks液）。

3．分装　在培养瓶内加入新配制的培养液约3ml，并用吸管反复吹打瓶壁，至细胞层全部脱落，再轻轻吹打细胞悬液，使细胞散开。

吹打时应按一定的顺序进行，即从培养瓶底部的一侧开始吹打至另一侧结束，尽量使每个部位的细胞都能被吹到。

吹打时不能太用力，尽量不产生气泡，避免损伤细胞。

在倒置显微镜下观察细胞，当贴壁细胞均已悬浮于培养液中，且细胞已分散单细胞或细胞团时，终止吹打。

取细胞悬液计数并用台盼蓝染色，计算细胞密度及细胞活力，据此对细胞悬液补加适量培养液稀释，调整细胞密度为1×

106/ml，将其分装到2瓶或多瓶中。

原代培养的细胞首次传代时，细胞密度宜大些，以使细胞尽快适应新的环境，利于细胞生存和增殖。

如原培养瓶为5ml培养液，分装2瓶时，则需补加培养液到10ml，混匀后分一半到另一培养瓶中。

在分装好的培养瓶上标明日期、细胞代号等标志。

4．培养与观察　轻轻摇动分装好的培养瓶，置CO2培养箱37℃培养。

接种后要每日观察培养液的颜色及细胞生长状况，通常，细胞传代培养2h左右，细胞即能贴壁生长，2～4h可形成单层。

培养过程中，可通过0.5%台盼蓝染色了解培养细胞中死、活细胞的比例。

悬浮细胞的传代培养:

少数细胞，如某些癌细胞、血液中白细胞，体外培养时为悬浮生长、不贴壁，其传代培养的方法不同于贴壁生长的细胞，可通过离心收集细胞后传代或直接传代。

1．离心传代　超净工作台内用吸管将培养瓶内的细胞吹打均匀，如有半贴壁的细胞应将其吹打下来。

将细胞悬液转移到无菌离心管中，平衡后800～1000/min离心5min，弃上清，加适量新配制的培养液打匀成细胞悬液。

细胞计数，按1：

2或1：

3的比例将细胞悬液稀释，分装于新的培养瓶中进行培养。

培养及观察等操作同贴壁细胞的传代培养。

2．直接传代　让悬浮细胞慢慢沉淀到瓶底，弃去上清液1/2～1/3后，用吸管吹打成细胞悬液，其后的操作同上。

培养细胞活力测定

1．接种细胞：

用0.25%胰蛋白酶消化HeLa细胞，并用培养基制成单个细胞悬液，以5×

104/ml接种于96孔培养板，每孔200μl，5%CO2、37℃培养３～５天。

整个实验分为3个组：

加药实验组、不加药对照组及不接种细胞也不加药的空白组。

每组8个复孔。

培养24h实验组加药处理。

继续培养至72h。

2．染色：

每孔加入20μl0.5%MTT溶液（5mg/ml），若实验组所加药物能与MTT反应，应先离心弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

继续培养4h。

3．离心：

与另一96孔板平衡后，1000r/min，离心10min，用力甩去上清。

4．溶解：

每孔加入200μl二甲基亚砜，避光振荡10min，以溶解紫色结晶。

5．测定：

用全自动酶标仪（bio-rad550型）测定波长570nm（490nm?

）处各孔的吸光值（OD值）。

实验组和对照组OD值以空白组OD值调零。

6．计算实验组细胞存活率、抑制率：

细胞存活率越小，说明实验组药物的作用强度越大；

抑制率越大，说明实验组药物的作用强度越大。

计算公式如下：

细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×

100%

抑制率=〔（对照组OD值一实验组OD值）/对照组OD值〕×

五.实验结果和记录

1．组织块法培养细胞的观察

培养24h后，倒置显微镜下可观察到组织块周围开始有少量的细胞。

一般最先长出形态不规则的游走细胞，接着长出成纤维细胞或上皮细胞，随着细胞的延长，组织块周围形成较大的生长晕，以后细胞生长加快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片（图7-1）。

即有少量细胞从组织块周围游离而出，当细胞从组织块游出

量增

时，应根据培养液颜色，补加或更换培养液。

培养液表面如有漂浮的组织块，要及时吸弃。

细胞生长良好时，10～15天可长成致密单层，需传代培养。

图7-1组织块周围细胞呈放射状向外扩展

2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察

正常情况下，倒置显微镜下可观察刚接种的细胞均呈圆形悬浮于培养液中，接种24h后可见许多细胞贴壁，细胞由圆形悬浮状态伸展成梭形（图7-2，图7-3）；

若细胞生长不良或培养液变红，应在无菌条件下，更换培养液。

培养3～4d时，细胞增殖旺盛，数量增多，细胞透明，颗粒少，界限清楚，可见细胞岛形成；

此时若培养液变黄、澄清，表明细胞生长，但营养成分不足，代谢产物堆积，CO2增多，可更换1/2新培养液或维持液。

此后，每3～4d,更换新培养液或维持液。

维持液与培养液的差别仅在于血清量为5%。

通常在7～10d,细胞基本形成致密单层，可进行传代培养。

图7-2细胞由圆形悬浮状态伸展成梭形并贴壁

图7-3扫描电镜观察到贴壁细胞的三维构造

六.注意事项

细胞培养的无菌操作要求

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。

准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试

1．器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材，如：

培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；

手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20min蒸气灭菌；

培养液、小牛血清、消化液等用G6滤器负压抽滤后备用。

2．无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。

为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。

操作前20～30min起动超净台吹风。

操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。

培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。

操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。

使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。

总之，在整个操作过程都应该在酒精灯的周围进行。

3．用灭菌的PBS（或<

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Hanks液）清洗组织块时冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对培养细胞的生长产生影响

古希腊哲学大师亚里士多德说：

人有两种，一种即“吃饭是为了活着”,一种是“活着是为了吃饭”.一个人之所以伟大，首先是因为他有超于常人的心。

“志当存高远”,“风物长宜放眼量”,这些古语皆鼓舞人们要树立雄心壮志，要有远大的理想。

　　有一位心理学家到一个建筑工地，分别问三个正在砌砖的工人：

“你在干什么？

”

　　第一个工人懒洋洋地说：

“我在砌砖。

”第二个工人缺乏热情地说：

“我在砌一堵墙。

”第三个工人满怀憧憬地说：

“我在建一座高楼！

　　听完回答，心理学家判定：

第一个人心中只有砖，他一辈子能把砖砌好就不错了；

第二个人眼中只有墙，好好干或许能当一位技术员；

而第三个人心中已经立起了一座殿堂，因为他心态乐观，胸怀远大的志向！

　　井底之蛙，只能看到巴掌大的天空；

摸到大象腿的盲人，只能认为大象长得像柱子；

登上五岳的人，才能感觉“一览众山小”;

看到大海的人，就会顿感心胸开阔舒畅；

　　心中没有希望的人，是世界上最贫穷的人；

心中没有梦想的人，是普天下最平庸的人；

目光短浅的人，是最没有希望的人。

　　清代“红顶商人”胡雪岩说：

“做生意顶要紧的是眼光，看得到一省，就能做一省的生意；

看得到天下，就能做天下的生意；

看得到外国，就能做外国的生意。

”可见，一个人的心胸和眼光，决定了他志向的短浅或高远；

一个人的希望和梦想，决定了他的人生暗淡或辉煌。

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