分子诊断学复习资料简答题部分Word文件下载.docx
《分子诊断学复习资料简答题部分Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子诊断学复习资料简答题部分Word文件下载.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
5.转座元件/基因是原核生物基因组的重要特征是指可移动的基因成分，即
能在一段DNA分子内部或两段DNA分子之间移动的DNA片段，又称跳跃基因。
）6.致病基因是致病原核生物基因的重要特征病毒基因组的特点：
1.基因组大小相差很大
2.结构分子具有多样性3.基因组多数是连续性，但RNA病毒往往不连续4.编码序列占基因组的90%以上，间隔区序列很少；
5.多为单拷贝，即每个基因只出现一次；
6.相关基因丛集、有重叠基因和不规则基因结构序列。
1、试述点突变的主要检测方法。
答：
对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接检测基因点突变的方法，如等位基因特异性寡核苷酸杂交（allelespecificoligonucleotide，ASO）、PCR-ELISA、等位基因特异性扩增（allelespecificamplification，ASA）、PCR-RFLP、基因芯片技术等进行诊断，例如β地中海贫血，可以使用ASO、PCR-RFLP联合基因芯片技术进行诊断。
对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性（single-strandconformationalpolymorphism，SSCP）、变性梯度凝胶电泳（denaturinggraientgelelectrophoresis，DEEG）、异源双链分析（heteroduplexanalysis，HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等方法，如Hopkins大学医学院的研究人员设计了47对PCR引物，分段扩增血友病A因子Ⅷ基因片段，进行DGGE分析，发现多态性片段后再进行DNA序列分析，几乎查清了所有临床轻中度病人的点突变。
2、试述限制性内切酶MstⅡ切割法诊断镰状细胞贫血的原理并图示。
答：
3、试述近端重组、远端重组概念。
在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22号内含子内（A1），另外两个位于X染色体的末端（A2、A3）。
A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失而发生严重的血友病（图15-5）。
其中与A2发生的重组称为近端重组，约占倒位的15％；
与A3发生的重组称为远端重组，约占倒位的85％。
4、简述TGGE/DGGE的基本原理
在TGGE中，随着温度的逐渐升高时，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。
部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构像，使得其电泳迁移率大大下降。
DNA分子的解链决定于该分子的解链温度，而Tm有强烈的序列依赖性，如在单取代突变中，若是A:
T被G:
C取代，将增加该双链DNA分子的Tm值。
而整个DNA分子序列对解链温度也有影响，若A:
T被T:
A替代，或G:
C被C:
G替代，分子的解链温度也会发生改变。
因此不同的DNA分子于其Tm不同，将于不同凝胶位置产生分枝使电泳迁移率降低，从而在凝胶上的不同位置形成条带。
DGGE的变性条件为热和固定比率的甲
酰胺、尿素。
这些梯度变性的功能就相当于TGGE中的温度梯度的功能，使不同DNA分子在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA分子分离。
5、简述变性高效液相色谱法检测基因变异的优点
DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性。
DHPLC与各种电泳法的比较SSCP分析片段长度105。
根据卫星DNA的长度，又可分成3种：
卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。
中度重复序列
这类重复序列主要比较大的片段串联重复组成，分散在整个基因组中，重复频度不等，如Alu家族、rRNA、tRNA和组蛋白等。
20、简述质粒的概念和特性，常用的质粒载体有哪几种？
质粒为细菌染色体外一些双链、共价闭合环状DNA分子，是能够进行独立复制并保持稳定遗传的复制子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
质粒一般具有以下特性：
①自主复制性，它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制；
②质粒不相容性；
③可扩增性；
④可转移性。
理想质粒载体应具备①具有松弛型复制子；
②在复制子外存在几个单一的酶切位点；
③具有插入失活的筛选标记；
④分子量相对较小，有较高的拷贝数。
常见的质粒载体有：
pBR322质粒、pUC质粒载体、pGEM系列载体等。
21、试述举2种质粒DNA提取的方法及应用。
[答案]质粒DNA提取的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。
1）碱裂解法：
在NaOH存在的强碱性的条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。
它是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。
2）煮沸裂解法：
是将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性。
对CCC质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，CCC质粒DNA可重新回复其超螺旋结构，通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清液中的质粒DNA。
本法只能用于小质粒DNA的小量或大量制备，适用于大多数从大肠杆菌菌株中分离出质粒DNA。
3）SDS裂解法：
它是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细菌，从而温和地释放出质粒DNA到等渗溶液中，然后用酚/氯仿抽提。
适用于大质粒DNA的提取。
22、简述哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有哪几种？
[本题答案]哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有：
酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法和异丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。
23、简述从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的主要方法有哪几种？
[本题答案]从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括DEAE-纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法、冷冻挤压法及现在有试剂盒供应的以硅为基础的纯化系统等。
24、简述磁性球珠分离法分离mRNA的原理。
[本题答案]磁性球珠分离法是基于寡聚（dT）与poly（A）的互补配对特性、用生物素标记寡聚（dT），通过寡聚（dT）与mRNA3’端poly（A）形成杂交体，这种杂交非常迅速，在1－2分钟内就可完成，可有效地除去rRNA,tRNA以及其他RNA,而后通过生物素与链亲和素顺磁性磁珠之间的相互作用来捕获这些杂交物而达到分离纯化。
25、描述质粒DNA的结构特点。
多数细菌的质粒核酸是环状双链DNA分子，没有游离的末端，每条链上的核苷酸通过共价键头尾相连。
质粒DNA分子通常具有三种不同的构型。
当其两条核苷酸链均保持完整环形结构时，为共价闭合环状DNA分子，这样的DNA常以超螺旋状态存在；
如果两条链中只有一条链保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口时，为半开环DNA；
若两条链均有缺口并发生断裂则成为线性DNA分子。
26、试述质粒的类型有哪些？
根据细菌染色体对质粒复制的控制程度是否严格可将质粒分为：
严紧型质粒和松弛型质粒。
按转移方式分为：
接合型质粒、可移动型质粒、自传递型质粒。
按质粒大小分为：
小型质粒、大型质粒。
按质粒的宿主范围分为：
窄宿主谱型质粒、广宿主谱型质粒。
按质粒的功能分为：
F质粒、R质粒、Col质粒。
27、线粒体DNA与核DNA有哪些不同之处？
非孟德尔的母系遗传。
mtDNA因位于细胞质中,表现为严格的母性遗传,不服从孟德尔遗传，绝大部分mtDNA是通过卵细胞遗传。
高突变率。
mtDNA突变率约为nDNA的10～100倍，此外mtDNA与有毒物质的结合频率比核DNA高数倍至数十倍。
异质性和复制分离。
异质性即突变mtDNA与野生型mtDNA以不同的比例共存于一个细胞内的现象。
复制分离即在细胞分裂的复制过程中,突变的和野生型的mtDNA随机进入子细胞的过程，复制分离的结果使突变mtDNA杂合体向突变纯合或野生纯合方向转变,但因突变复制具有优势,故易产生突变积累，突变积累的程度不同,突变mtDNA在群体中的多态性程度也不同。
阈值效应。
每个细胞的mtDNA有多种拷贝，而一个细胞mtDNA编码基因的表现型依赖于一个细胞内突变型mtDNA和野生型mtDNA的相对比例，mtDNA突变导致氧化磷酸化水平降低,当能量降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时即达到了mtDNA表达的能量阈值，可引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状，这就是阈值效应。
半自主复制与协同作用。
mtDNA虽有自我复制、转录和编码功能，但该过程还需要数十种nDNA编码的酶参加，因此mtDNA基因的表达同时也受nDNA的制约，两者具有协同作用。
28、何谓线粒体病？
简述线粒体病的遗传学分类。
线粒体病是指于线粒体呼吸链功能不良所导致的临床表现多样化的一组疾病。
临床表现常见为眼睑下垂、外眼肌麻痹、视神经萎缩、神经性耳聋、痉挛或惊厥、痴呆、偏头痛、类卒中样发作等。
从核基因缺陷和线粒体基因缺陷的角度对线粒体病进行遗传学分类可分为三种类型：
点突变，mtDNA的大规模缺失或插入和源于核DNA缺陷引起mtDNA缺失。
29、病毒的基本结构成份主要有哪些？
毒没有完整的细胞结构，四种基本结构成份组成：
①一种核酸（DNA或RNA）组成的病毒基因组。
②病毒基因组编码的衣壳蛋白组成的衣壳。
③宿主细胞质膜系统的包膜。
④病毒颗粒中的其它内容物，包括酶、核酸结合蛋白及金属离子等。
30、国际病毒分类委员会将病毒分成哪几类？
国际病毒分类委员会制定了《国际病毒分类与命名原则》。
根据病毒的基因组组成及复制方式，可将病毒分为如下几类：
DNA病毒
第一组：
双链DNA病毒第二组：
单链DNA病毒RNA病毒
第三组：
双链RNA病毒第四组：
正链RNA病毒第五组：
负链RNA病毒
DNA与RNA逆转录病毒
第六组：
RNA逆转录病毒第七组：
DNA逆转录病毒亚病毒因子
卫星类病毒朊病毒
31、简述长病毒末端重复序列的特点和作用。
逆转录病毒基因组RNA在逆转录后生成的双链DNA中，两端有长末端重复序列结构。
LTR在结构与功能上与上述重复序列不同。
LTR中的重复序列只占一部分，另外还包括单一序列。
5＇端的LTR包含许多特定的基因表达调控区域，是一组真核生物增强子和启动子单位，而3＇端的LTR具有转录终止的作用。
另外，逆转录病毒基因组利用LTR中的重复序列形成环状结构，在整合酶作用下整合入宿主细胞基因组内。
53蛋白质组学的研究特点有哪些？
①整体性②揭示生命的动态性过程③体现生命现象的复杂性32、等电聚焦凝胶电泳的原理是什么？
依据蛋白质分子的净电荷或等电点进行分离的技术。
在等电聚焦过程中，电场所采用的载体两性电解质含有脂肪族多氨基多羧酸，可在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续pH梯度，蛋白质分子在一个载体两性电解质（ampholyte）形成的连续而稳定的线性pH梯度中电泳，当蛋白质迁移到其等电点位置时，净电荷为零，在电场中不再移动，因此可将各种不同等电点性质的蛋白质分离开来33、简述酵母双杂交系统的优缺点。
酵母双杂交系统所具有的优点：
①蛋白质作为被研究的对象不用被纯化；
②检测在活细胞内进行，可以在一定程度上反映体内的真实情况；
③于这一系统可以反映基因表达产物的累积效应，因而可检测存在于蛋白质之间微弱或短暂的相互作用；
④采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，可用于分析多种不同功能的蛋白。
局限性：
①双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
②于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。
③双杂交只是反映蛋白质间能发生作用的可能性，这种可能还必须经过其他实验验证，尤其要与生理功能研究相结合，否则可能会误入歧途。
34、蛋白质间互作鉴定：
蛋白质亚基的聚合：
线性、环状、螺旋、球状、交叉聚合分子识别：
抗原与抗体、配体与受体、酶与底物分子的自我装配：
核糖体、细菌鞭毛、病毒的自动装配
多酶复合体：
丙酮酸脱氢酶复合体包括丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶。
蛋白质间作用力：
氢键：
肽键之间，主－侧、侧－侧链之间范德华力：
取向力、诱导力、色散力
疏水键：
非极性基团为了避开水相二群集在一起的作用力。
离子键：
正负离子之间的静电引力所形成的化学键。
蛋白质相互作用的研究方法:
体外：
肽蛋白质亲和层析；
亲和印迹；
免疫沉淀；
交联等。
体内：
酵母双杂交系统；
噬菌体展示技术；
生物传感芯片质谱；
蛋白质定点诱变。
蛋白组学研究内容：
1.蛋白质分离；
2.蛋白质的鉴定；
3.蛋白质-核酸间相互作用；
4.蛋白质与蛋白质的相互作用。
蛋白组学研究的特点：
1）整体性和规模化；
2）动态性和网络化；
3）复杂性和综合技术化；
蛋白质组研究常用技术：
1）蛋白质分离技术；
2）蛋白质检测与图像分析以及鉴定技术；
3）蛋白质互作研究技术；
4）生物信息学分析技术。
35、蛋白质组学的研究内容有哪些？
蛋白质组学的研究包括两个方面：
一是针对蛋白质表达模式的研究，一是在蛋白质功能模式方面的深入分析。
36、PCR，聚合酶链反应DNA模板（template）：
靶基因
原料：
dNTPs催化酶：
耐高温的DNA聚合酶
一对引物：
扩增序列的决定者其与靶基因两侧序列互补Mg2+和BufferPCR反应过程----三步曲
1.高温变性：
在高温下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板
2.低温退火：
在低温下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链
3.适温延伸：
在耐热DNA聚合酶的最适温度下，以引物的3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
37、PCR衍生技术（pcr技术有哪些）：
逆转录PCR、反向PCR、巢式PCR、标记PCR、多重PCR、原位PCR、不对称PCR、定量PCR、锚定PCR38、如何提高PCR扩增的特异性？
①升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性
②缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会③降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发④改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性⑤引物设计的特异性⑥减少循环次数
⑦热启动：
即首先将模板变性，然后在较高温度时加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严格性，使扩增更特异⑧采用两对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。
39、PCR检测技术有何临床应用：
（1）PCR在病原微生物的检测中的应用；
PCR在遗传病中的应用；
PCR在肿瘤中的应用；
其它方面的应用：
PCR技术除用于临床诊断和治疗外，还可用于DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。
40、影响PCR反应的因素有哪些？
PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。
41、影响PCR反应的因素有哪些？
42、简述bDNA信号放大系统的原理。
分枝DNA是人工合成的带有侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。
以bDNA为基础建立的连续放大DNA信号以检测DNA的技术称为分枝DNA信号放大系统。
bDNA信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、放大体和标记探针。
首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5′端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；
再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；
再加入前放大体，该组探针的一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体的主链部分的序列互补结合，分枝DNA主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。
利用bDNA信号放大系统可在每个靶序列上结合60～300个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA定量。
43、简述链末端终止法测定DNA序列的原理
利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸作为链延伸终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，此推知待测模板链的序列。
44、简述化学法测定DNA序列的基本原理
化学法是对待测DNA进行化学降解。
在化学法的测序系统中，先对待测DNA末端进行放射性标记，然后分成4组或5组互为独立的化学反应体系，每一组用不同的化学试剂特异地针对某一种或某一类碱基进行化学切割，通过化学降解后产生长短不一的DNA片段，其长度取决于改组反应所针对的碱基在待测DNA片断中的位置，将各组反应产物通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。
45、Sanger双脱氧链终止法,全称：
双脱氧链末端合成终止法
原理：
利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立4种互相独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷酸三磷酸作为链延终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5’到3’方向读出新合成链序列，此推知待测模板链的序列。
每个测序反应体系的组成：
聚合酶；
2.单链DNA模板；
3.带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物；
+；
5.原料-dNTPs（dATP,dGTP,dCTP和dTTP）；
6.终止剂-ddNTPs（ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP）
测序体系的关键成分：
链终止剂，2’，3’-二脱氧核糖核苷酸用于测序的变性聚丙烯酰胺凝胶模板，即待测序的DNA片段引物。
酶促测序反应中，利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物DNA聚合酶放射性同位素标记的dNTP：
α-35S-dNTP
焦磷酸测序技术，PPi最终转化为可检测的光信号，并PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，随后，加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
产生的荧光信号自动传入分析系统，直接测读靶DNA序列。
特点：
1.无需电泳，也无需荧光标记，操作极为简便，具快速、准确、经济和实时；
2.阅读能力已从100bp至400bp；
3.该技术具有多种不同的用途。
46、简述哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有哪几种？
哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有：
47、简述重组DNA技术的原理及技术。
重组DNA是在体外利用限制性内切酶，将不同的DNA分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA片段与载体连接，从而组成一个新的DNA分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA片段。
经重组的DNA分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。
大致步骤包括：
①目的基因的获取；
②载体的选择；
③目的基因与运载体连接成重组DNA；
④重组DNA导入受种细胞；
⑤重组体的筛选
49、简述黏性末端DNA重组体的构建过程。
目的基因和载体可同一种限制酶切割后产生，或不同的限制酶切割形成互补黏性末端，经退火，彼此间很容易按碱基配对原则形成氢键。
然后DNA连接酶催化连接接头处的缺口，形成重组质粒。
载体DNA在限制酶切割后，用碱性磷酸酶处理，除去5’端磷酸基，以避免载体DNA自身环化。
50、举例说出重组DNA技术在医药领域的应用。
可以利用重组DNA技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；
开发基因工程药物和疫苗用于临床；
建立基因诊断、治疗技术，为疾病的预防、治疗提供新方法、新技术。
具体可用于基因诊断：
基因诊断是从基因水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷；
基因治疗：
是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞取代靶细胞中的缺陷基因，从而达到治疗疾病目的的方法；
基因工程药物、疫苗和抗体的研究和制备；
利用基因敲除或转基因技术可改造生物、培育新的生物品种或用于药物筛选和新药评价等。
51、基因芯片的主要类型及其特点从支持物来分①薄膜型：
聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜②玻片型：
生产此类产品的公司如Affimetrix从点阵的制备方法来分①原位合成型②合成点样型
根据探针片段长度分①Oligo-Chip：
约8~25nt，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异和测序②cDNA-Chip：
5000nt，基因组结构分析根据用途分：
基因变异检测芯片表达谱芯片功能基因芯片.52、生物芯片：
采用平面微细加工技术将大量生物样品有序地固化于支持物表面此组成的密集二维生物样品的微阵列。
原理：
分子间
升级会员 