BY2细胞的培养与转化.docx
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BY2细胞的培养与转化
BY-2Cells:
Cultureand
TransformationforLiveCellImaging
BASICPROTOCOL1
ESTABLISHINGABY-2SUSPENSIONCULTURE
BY-2悬浮培养的建立
ThisprotocoldescribesthemethodtoestablishaBY-2cellsuspensionfromaBY-2oranothertobaccocallus.Subculturingthecellsistechnicallytermedpassaging（alsoseeBasicProtocol2）.Itisadvisabletoworkinduplicateoreventriplicatewhenestablishingasuspensionculture.Thisallowsinitiationoffreshsuspensionsofthesametransformedcelllineshouldanycontaminationoccur.
这个实验步骤描述了通过BY-2或者其他的烟草愈伤组织建立BY-2细胞悬液的方法。
传代培养细胞是一个传代的专有名词。
当建立悬浮体系的时候最好是一式两份或一式三份的进行。
这样就使得一旦一个转化的细胞株的污染发生的时候，又可以开始新的细胞悬浮。
Materials
Calliofwild-typeand/ortransformedBY-2cells（availablefromvarious
laboratories）grownonsolidBY-2medium（seerecipe）inpetridish50-ml
conicalflaskscontaining20mlliquidBY-2medium（seerecipe）,coveredwithaluminumfoilandautoclaved
Suitablefilter-sterilizedantibiotics,
forculturingtransformedBY-2cellsonly
Razorblades,
sterilePacketofaluminumfoilsquaresforcoveringflasks,sterile
Shakingincubator,25︒C
1.Cuta2-cm2pieceofwild-typeortransformedBY-2calluswithasterilerazorbladedirectlyonthepetridishonwhichthecalliaregrowing.
2.Loosenaluminiumfoilfromtopofasterile50-mlconicalflaskcontaining20mlliquidBY-2medium.Lightlyflameneckofflask.Addsuitablefilter-sterilizedantibioticsifneeded.Openasterilepacketofaluminumfoilsquaressothattheyarereadilyaccessible.
材料
转化过的或野生型的BY-2细胞的愈伤组织（不同的实验室都有）生长于培养皿的BY-2固体培养基上（见配方）
装有20ml液体BY-2培养基（见配方）的三角瓶，用铝膜纸封口高温灭菌。
过滤灭菌-转化BY-2细胞相关的抗生素
无菌的保险刀片
一捆方形的铝膜纸用来包烧瓶的，灭菌
25度摇床
1、直接在培养基上用灭菌的刀片切2平方厘米的野生型或者是转化的BY-2愈伤组织，并让其在培养基上生长。
2、松开灭菌的装有液体培养基的三角瓶的铝膜封口，用火烧瓶口，加入合适的抗生素。
打开一个正方形的铝膜纸，先做好准备。
Thiswillaidthespeedatwhichtheitemsinthehoodcanbehandledandhencewillreducethepossibilityofcontamination.
Theflasksshouldbeopenforasshortatimeaspossibletoavoidcontamination.Avoid
passinganything（e.g.,handsorsleeves）overtheopenflasks.
Thepreparationandstorageofantibioticsshouldbeaccordingtomanufacturer’sinstructions.Antibioticsshouldbefiltersterilizedandhandledassterilematerial.Tofiltersterilizetheantibioticsolution,astocksolutionoftherequiredconcentration（usually100⋅）isprepared.Theantibioticsolutionisaspiratedintoasterilesyringewithoutaneedle.A0.2-_msyringefilterisattachedtothesyringe,andthesolutionispressedthroughthefilterintoasteriletube.
这样可以加快在工作台上的实验速度继而降低污染的可能性。
烧瓶的打开时间应该尽可能的的短来避免污染。
避免任何东西经过打开的烧瓶（如，手或袖子）
抗生素的准备和存放应该遵守抗生素制造商的说明书。
抗生素应该用过滤灭菌，而且用灭菌过的材料来存放。
准备的母液浓度一般是100X。
抗生素溶液用灭菌了的注射器吸上来。
0.2-_m的注射器式灭菌器装在注射器上以后，推注射器，将经过过滤器的溶液装入灭菌了的管中。
3.Transferthecutcallustothe50-mlflaskwithmedium.
将切下来的愈伤组织转移至装有50ml培养基的烧瓶中。
Whenestablishingsuspensionculturesitisbesttobegininasmallvolumeasthecellsgrowbetter。
Tencouragegrowththeauthorshavefoundthatsubculturingnewlyestablishedsuspensions1to2weeksafterplacingcalliinliquidmedium,thecultureshouldbequitethick—likerunnytomatoketchup.Passagingculturesatlowerdilutionratio（1:
10insteadof1:
20）canalsoencouragegoodsuspensionculturegrowth.Oncethecellsaregrowingwellinthesmallvolumetheycanbesubculturedintolargervolumesofmedium.
当建立了悬浮培养时，最好是先从小的容积开始，这样细胞会长得好一些。
为了使细胞生长得更好，作者发现新的继代悬浮培养是在将愈伤组织放入液体培养基后的1-2周。
培养物应该是非常浓稠的，像半液体状的番茄酱。
继代培养在一个低一点的稀释比（1:
10而不是1:
20）可以使悬浮培养生长得更好。
一旦细胞在小的容器中长得很好时，就可以将其继代培养转入大一些的装有培养基的器中了。
4.Gentlypipettheculturingmediumupanddowntobreakupcallus.
轻轻的上下吸打培养基，打散愈伤组织。
5.Resealtheflaskwithanewsquareofaluminiumfoil.
用新的方形的铝膜纸重新密封烧瓶。
6.Placecellsinashakingincubatorsetat130rpmand25°Cwithilluminationofchoice.
将细胞放在摇床中，设置130rpm，25度，光照设置是可选择的
Aflat-bedorbitalplatformina25°Ccultureroommayalsobeused.
BY-2cellsuspensionsmaybekeptinthedark.Anilluminationregimeof16hrlightand8rdarkcanalsobeused.
Cellsshouldbesubculturedafter7days（seeBasicProtocol2）.
一个平的板在25度的培养空间是需要的，BY-2细胞的悬浮培养需要在黑暗的环境中，或者是16小时的光照，8小时的黑暗也是可以的。
细胞的继代培养要在7天以后（见基本操作2）
BASICPROTOCOL2
ROUTINECULTUREOFBY-2CELLS
常规的BY-2细胞培养
ThisprotocoldescribestheroutinemethodtocultureBY-2cellsandtomaintainsuspensionandcalluscultures.AsdescribedinFigure1.7.1,theprotocolrequiresliquidandlidmedia
这个操作方法描述了常规的培养BY-2的方法和保持继代和愈伤组织的培养。
像如1.7.1描述的一样，这个操作守则需要液体的还有固体的培养基。
Materials
50-mlconicalflaskscontaining20mlliquidBY-2medium（seerecipe）,coveredwithaluminumfoilandautoclavedSuitablefilter-sterilizedantibiotics,fortransformedBY-2cellsonlyWild-typeortransformedstationary-phaseBY-2cells（i.e.,7-day-oldcultures）growninsuspension（seeBasicProtocol1）Packetofaluminumfoilsquaresforcoveringflasks,sterileTrimmed1-mlpipettips（i.e.,4to5mmcutofffromnarrowend）,sterileShakingincubator,25°C
材料
50ml的三角瓶装有20ml的液体的BY-2液体培养基，用铝膜纸封住，高温灭菌。
抗体，专门用来转化BY-2细胞的，过滤灭菌。
野生的或转化的，生长于悬浮液的稳定的BY-2细胞，（例如。
7天的培养物）（见基本操作1）
一捆方形的铝膜纸用来包烧瓶的，灭菌
斜剪好的枪头灭菌，从枪头的前端4-5毫米处斜剪，25度的摇床。
1.Loosenaluminiumfoilfromtopofasterile50-mlconicalflaskcontaining20ml
liquidBY-2medium.Lightlyflameneckofflask.Addsuitablefilter-sterilized
antibioticsifneeded.Openasterilepacketofaluminumfoilsquaressothattheyare
readilyaccessible.
3、1、松开灭菌的装有20mlBY-2液体培养基的50ml三角瓶的铝膜封口，用火烧瓶口，加入合适的抗生素。
打开一个正方形的铝膜纸，先做好准备。
图A为常规培养BY-2细胞的方法（参见操作方法2）
图B稳定转化子的产生（参见操作方法4）
Thepreparationandstorageofantibioticsshouldbeaccordingtomanufacturer’sinstructions.Antibioticsshouldbefiltersterilizedandhandledassterilematerial.Tofiltersterilizetheantibioticsolution,astocksolutionoftherequiredconcentration（usually100×）isprepared.Theantibioticsolutionisaspiratedintoasterilesyringewithoutaneedle.A0.2-_msyringefilterisattachedtothesyringe,andthesolutionispressedthroughthefilterintoasteriletube.
抗生素的准备和保存应该遵循生产商的说明。
抗生素需要被过滤灭菌并被保存在灭菌的容器中。
用来过滤灭菌的溶液，通常的储存浓度是100×。
抗生素溶液用灭菌了的注射器吸上来。
0.2-_m的注射器式灭菌器装在注射器上以后，推注射器，将经过过滤器的溶液装入灭菌了的管中。
2.Useatrimmed1-mlpipettiptotakea1-mlaliquotofwild-typeortransformedstationary-phaseBY-2cellsfromtheirflask.
Theendsofuncuttipswillbetoonarrowtoalloweasyentryofcells.Arazorbladecanbe
usedtocutthetips,andcuttipsareautoclavedasnormal.
Forlargervolumesofcells,use100mlBY-2mediumina250-mlflask.For100-ml
suspensioncultures,passage10mlcellsinto100mlfreshmedium.
3.Removefoilfromthenewflaskandpipetthecellaliquotdirectlyintothefresh
medium.
4.Coverthenewflaskwithanewsquareofaluminumfoilandsealfirmly.
5.Placecellsinashakingincubatorsetat130rpmand25°Cwithilluminationofchoice
for7days.
Aflat-bedorbitalplatformina25°Ccultureroommayalsobeused.
BY-2cellsuspensionsmaybekeptinthedark.Anilluminationregimeof16hrlightand8
hrdarkcanalsobeused.
After7days,cellsshouldbepassagedagain.
2、用
BASICPROTOCOL4
基本操作4
STABLETRANSFORMATIONOFBY-2CELLSMEDIATEDBYAGROBACTERIUMFORVISUALIZATIONOFSUBCELLULARORGANELLES
由农杆菌介导的亚细胞器自显的BY-2细胞的稳定转化
ThisprotocolinvolvestheproductionofBY-2linesthatstablyexpressGFPtargetedtosubcellularstructuresforsubsequentlivecellimaging（seeFig.1.7.3）.TheproceduresaresuitableforothertobaccocelllinesandmaybemodifiedforArabidopsisthalianasuspensioncellsaswell
这个操作为构建可以在BY-2细胞中目标亚细胞结构中稳定表达的GFP，并在实时亚细胞图片观察中能看到的。
（见图1.7.3）这个操作也适合其他的烟草细胞系，在改良后也可以适用于拟南芥的悬浮细胞。
NOTE:
TotransformBY-2cells,abinaryvectorthatcanbetransformedintoagrobacteriaisneededandcanbethesameasisusedtotransformtobaccoandArabidopsisplants.Thebinaryvector,inwhichthefluorescentproteinmarkerissubcloned,mustcarrytworesistancemarkers（antibioticresistance）.Oneisaselectablemarkerforbacteria—toselectpositivetransformantsafterbacterialtransformation—andtheotherisaselectablemarkerforplants,whichwillallowthegrowthonlyoftransformedplantcells.Whenworkingwiththeseselectionmarkers,itisveryimportanttofollowthemanufacturer’sinstructionsforthespecificantibioticinuse.FactorssuchaslightandpH,forexample,mayalterthepropertiesoftheantibioticsandthusaffecttheyieldofstabletransformants.
注意：
为了转化BY-2细胞，需要一个二元的能转入农杆菌的载体，同时也能一样转入烟草和拟南芥的植株中。
这个二元载体，必须有荧光蛋白标记的亚克隆，同时带有两个抗体标记。
一个是细菌筛选标记-在细菌转化后用来筛选阳性的转化细胞；另一个是植株的筛选标记，使得只有在转化了的植株细胞才能生长。
当使用这些筛选标记时，根据制造商的说明来使用特定的抗生素是很重要的。
一些影响因子，例如光照和PH值，可能会改变抗生素的性能，从而影响到转化细胞产量的稳定性。
Materials
YEBmedium（seerecipe）containingappropriatefilter-sterilizedbacterial
selectionantibiotic
AgrobacteriumtumefacienstransformedwithvectorcontainingappropriateGFP
construct（e.g.,strainGV3101:
:
pMP90;KonezandSchell,1986）transformed
withanotherplasmid（e.g.,pVKHI8En6,pBII21）whichcontainsGFPandthe
insertofinterest.
3-day-oldwild-typeBY-2suspensionculture（seeBasicProtocol1）
LiquidBY-2medium（seerecipe）,sterile
SolidBY-2medium（seerecipe）plateswithplantselectableantibiotic,100⎧g/ml
carbenicillin（seerecipe）,and20⎧g/mltimentin（seerecipe）
Shakingincubator,25︒C
Trimmed1-mlpipettips（i.e.,4to5mmcutofffromnarrowend）,sterile
5-and10-cmpetridishes,sterile
1.5-mlmicrocentrifugetubes,sterile
Forceps,sterile
材料
YEB培养基（见配方）含有过滤灭菌后的细菌筛选抗生素
转化过的农杆菌，转化的载体中含有合适的GFP结构（例如：
菌株GV3101:
:
pMP90;KonezandSchell,1986）转化的其他质粒（例如：
pVKHI8En6,pBII21），其中也包含GFP和插入片段。
3天的野生BY-2悬浮培养物（见基本操作1）
液体BY-2培养基（见配方），灭菌
固体BY-2培养基（见配方），加入植株筛选抗生素100⎧g/ml羧苄青霉素（见配方）和20⎧g/ml特美汀（见配方）
25度摇床
斜剪的1-ml枪头（从枪头的前端4-5毫米处斜剪）灭菌
5-和10-cm的培养皿，灭菌
1.5-ml微量离心管，灭菌
镊子，灭菌
Growagrobacteria
1.Inoculate5mlYEBmediumcontainingappropriatefilter-sterilizedbacterialselectionantibioticwithasin
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