法国梧桐花粉主要变应原Pla a 1的纯化和鉴定Word下载.docx

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结论：

已测定法国梧桐花粉的大多数相关变应原。

对这种花粉特有的主要的变应原Plaa1已进行提纯和特性鉴定。

关键词：

色谱层析法、法国梧桐、主要变应原、悬铃木、肌动蛋白抑制蛋白

梧桐树或无花果树是广泛种植于美国和西欧的观赏树木，属于悬铃木属，也称法国梧桐，是一种在大多数西欧城市中最常见的树木。

在一些西欧国家，花季时可检测到高浓度的这种花粉[1]-[4]，几乎达到西班牙马德里花粉总量的14%，1994年当地记录约有7.3万棵法国梧桐[5]。

尽管发现浓度很大，但是却认为法国梧桐是低致敏花粉。

然而，最近在西班牙进行的研究显示皮肤点刺试验（SPT）法国梧桐花粉呈阳性的不同差异，范围从5%至56%，这取决于研究的地区[5]-[6]。

虽然近几年来法国梧桐花粉在致敏反应中越来越重要，但是几乎没有报道过关于该花粉中与IgE反应的蛋白质的描述数据[6]-[7]。

在本研究中，对导致单一过敏和多敏的梧桐花粉过敏患者产生花粉病症状的变应原进行了描述。

而且，首次提纯了梧桐花粉主要变应原，并且阐述了它的生物化学性质和致敏重要性。

实验材料与方法

患者

患者表现为对IgE介导的法国梧桐花粉过敏[8]，相应地伴有季节性或常年性鼻炎、哮喘，或两者兼而有之的病史，与皮肤点刺试验强烈反应（西班牙毕尔巴鄂），并且产生法国梧桐花粉的特异性IgE水平要比类似酶联过敏原吸附测试（EAST）高出两个级别。

12名患者（5名女性和7名男性患者，年龄为25—50岁，平均年龄为42岁）法国梧桐花粉单一过敏。

18名患者（6名女性和12名男性患者，年龄为14—66岁，平均年龄为42岁）法国梧桐过敏，也对其他花粉过敏，草和橄榄花粉就是最重要的种类。

特异性IgE水平通过EAST（Hytec系列特异性IgE酶免疫测定，Hycor生物医学公司，德国卡塞尔）定量测得，如制造商所描述，将法国梧桐花粉提取液结合到纸盘上[9]。

花粉粗提液的制备

法国梧桐、黑麦草和油橄榄树的花粉粗提液如前所述制备[10]。

用Bradford法（考马斯亮蓝法）测定每种提取液的蛋白质浓度[11]。

18kDa的变应原的提纯和N末端氨基酸分析

离子交换层析法：

法国梧桐花粉提取液过HiTrapSP柱（AmershamPharmaciaBiotech，瑞典乌普萨拉）分离，在AKTA-prime蛋白质纯化设备（AmershamPharmaciaBiotech）中使用含NaCl0.3，0.5和1.0M的不连续梯度的20mMpH6.0的磷酸缓冲液进行平衡。

通过SDS-PAGE电泳和专门与这种花粉反应的患者血清（图1A，第二道）孵育进行免疫印迹来分析分离组分的致敏活性。

凝胶过滤色谱层析法：

将集中的活性组分浓缩，适用在葡萄糖凝胶Superdex75柱，在SMART设备（AmershamPharmaciaBiotech）中使用含NaCl0.15M的20mMpH8.0的Tris缓冲液进行平衡。

所有可分辨峰的组分分别集中，并进行SDS-PAGE免疫印迹分析。

反相色谱层析法：

集中的活性组分过μRPCC2/C18反相柱（AmershamPharmaciaBiotech），在SMART设备中使用含0.1%三氟乙酸（TFA）的10-45%浓度梯度的乙腈。

与阳性血清反应的组分经集中、透析、浓缩，保存于-20℃。

依据埃德曼的降解技术，使用494Procise蛋白质测序仪（PEBiosystems，德国威特史丹特）对Plaa1的N末端氨基酸进行测定。

免疫检测和免疫印迹抑制实验

蛋白质在还原[12]和非还原条件下进行SDS-PAGE电泳分析，并经考马斯亮蓝R250染色显现出来。

分离的蛋白条带电泳转移到聚偏二氟乙烯上（PVDF膜）[13]，在室温下用含有0.1%吐温-20的TBS缓冲液封闭1小时。

膜与过敏患者血清（用含0.1%吐温-20的TBS缓冲液1:

4或1:

6稀释）在4℃下孵育过夜，然后与IgE多抗—亲和素辣根过氧化物酶孵育，按照生产商的建议（ECL-Plus，AmershamPharmaciaBiotech）通过化学发光的方法进行检测。

免疫印迹抑制实验使用混合的患者血清进行。

粗提液样品经SDS-PAGE电泳分离并且如上所述电转移到膜上。

在与膜接触前，混合的血清（用封闭液1:

6稀释）与每种抑制剂或牛血清白蛋白（BSA）在4℃下预孵育过夜。

如前所述[14-15]，得到抗肌动蛋白抑制蛋白（Profilin）Olee1和Lolp1的单特异性兔抗血清。

使用通常的色谱层析法纯化油橄榄树的肌动蛋白抑制蛋白Olee1和Lolp1[15-17]。

琼脂糖等点聚焦

在琼脂糖凝胶板（FMCBioProducts，美国明尼苏达州罗克兰）上进行等点聚焦，pH值为3-10，分离的蛋白质由毛细管转印到PVDF膜上[18]，室温下用含0.1%的吐温-20封闭1小时，如上所述进行孵育。

由此产生的电泳图谱在GS-710图像分析仪（Bio-RadLaboratories，美国加利福尼亚州里士满）中进行图像分析。

旋转异构酶法

按照Cadot等人[19]描述的方法测定旋转异构酶活性。

以在390nm处吸光度的增加检测在HEPES缓冲液（35mmol/L，pH8.0）中糜蛋白酶（2μ-mol/l）对显色肽（琥珀酰—丙氨酸—丙氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—对硝基苯胺，10μmol/L）的裂解速率。

糖蛋白检测方法

依照制造商的建议，使用DIG多糖检测试剂盒（罗氏制药，德国曼海姆）测定用于印迹的纯化的18kDa蛋白质的糖蛋白。

遵循供应商的说明书，使用Hi-Trap外源凝集素试剂盒（AmershamPharmaciaBiotech）鉴定18kDa蛋白质与不同琼脂糖耦合的外源凝集素的特异性结合。

实验结果

法国梧桐花粉过敏患者血清的IgE活性

在标准条件下用PBS提取法国梧桐花粉粗提液平均含有8.2%蛋白质。

还原条件下进行花粉粗提液SDS-PAGE电泳后，由特异性IgE免疫检测分别测试30名法国梧桐花粉过敏患者的血清（图1）。

单一过敏和多敏患者显示出不同的IgE结合图谱。

通过来源于单一过敏患者的血清，检测出法国梧桐花粉粗提液中主要变应原的表观分子量为15，18，43和58kDa，普遍率分别为16%，92%，83%和42%。

多敏患者血清显示了表观分子量为13，15，18，43，54-59kDa的致敏组分，普遍率分别为50%，78%，83%，83%和67%。

图1.法国梧桐花粉粗提液的免疫球蛋白（Ig）E-免疫印迹分析。

样品（4μg蛋白质）经SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜，与法国梧桐花粉单一过敏（A）或多敏（B）患者的单个血清和非过敏患者（泳道C）的混合血清孵育。

法国梧桐花粉的交叉反应

进行酶联过敏原吸附测试—抑制性实验来建立法国梧桐花粉提取液和黑麦草，油橄榄树、欧蓍草花粉之间的任何交叉反应。

在使用多敏患者的混合血清时，法国梧桐花粉提取液的IgE活性被黑麦草和油橄榄树提取液部分抑制（图2A）。

法国梧桐花粉提取液与抗肌动蛋白抑制蛋白特异性多克隆抗体孵育表明梧桐花粉提取液中肌动蛋白抑制蛋白的存在分子量为15kDa。

使用特异性Olee1-抗血清没有检测出相似于Olee1的蛋白质（未显示数据）。

正如预计的，单一过敏患者的混合血清没有表现出法国梧桐和黑麦草，油橄榄树、欧蓍草花粉提取液之间的交叉反应（图2B）。

图2.（A-B）IgE-EAST抑制性实验。

与法国梧桐（）、黑麦草（）、油橄榄树（）和欧蓍草（）花粉提取液孵育后，多敏患者（A）和单一过敏患者（B）混合血清的IgE结合性的抑制。

18kDa变应原的提纯

法国梧桐花粉粗提取液经阳离子交换柱首先富集碱性蛋白，然后逐步洗脱（图3A）。

集中、浓缩0.3MNaCl洗脱时出现的致敏组分，过葡萄糖凝胶Superdex75柱。

分子量为15-25kDa的致敏活性组分经反相色谱层析进一步提纯。

使用这种方法可以得到7个分辨峰，但是只有经40%乙腈洗脱产生的峰表现出致敏活性。

在还原条件下分离蛋白质的SDS-PAGE电泳结果得到分子量为18kDa的单一条带（图3D），非还原条件下得到的电泳条带分子量为16kDa（未显示数据）。

纯化的18kDa蛋白经凝胶过滤层析得到的表观分子量为18±

3kDa，显示出该蛋白的单体性质。

经分离的法国梧桐花粉变应原的最终含量为PBS提取的蛋白的0.08%。

根据30名过敏患者的血清得到的结果，因为超过50%的法国梧桐花粉过敏患者（87%）识别该蛋白，所以认为它是主要变应原，并且由世界卫生组织/国际免疫学会联合会变应原命名小组委员命名为Plaa1。

图3.法国梧桐花粉提取液中Plaa1的提纯。

（A）法国梧桐花粉提取液过HiTrapSP柱的洗脱图。

（B）IgE活性组分过葡萄糖凝胶Superdex75柱的洗脱图。

（C）活性组分过μRPCC2/C18反相柱的洗脱图。

箭头表示IgE活性组分。

（D）法国梧桐花粉提取液经SDS-PAGE电泳分离蛋白（泳道1）、过HiTrapSP柱（泳道2）、葡萄糖凝胶Superdex75柱（泳道3）、过μRPCC2/C18反相柱（泳道4）的活性组分的考马斯亮蓝染色图。

泳道5表明纯化蛋白的IgE免疫印迹结果。

蛋白特性

通过糖类与琼脂糖耦合的外源凝集素的结合能力判断其在Plaa1中的存在，这些凝集素来源于麦芽、小扁豆、花生和刀豆，表现出对糖的不同亲和力。

除了甘露糖，葡萄糖，半乳糖或耦合到蛋白核心的N-乙酰葡萄糖氨基端外，被测试的凝集素没有结合上Plaa1。

按照轻度高碘酸钾处理，用商业试剂盒，进一步进行Plaa1印迹的糖蛋白检测，同样得到阴性结果。

这些结果都表明Plaa1不太可能是一种糖蛋白。

进行反相色谱层析之前，部分纯化的Plaa1制剂用于测试旋转异构酶活性，但是未检测出旋转异构酶活性。

得到的Plaa1高度纯化物以12个末端残基进行N-末端氨基酸测序。

氨基酸测序的结果是丙氨酸—天冬氨酸—异亮氨酸—缬氨酸—谷氨酰胺—甘氨酸—苏氨酸—半胱氨酸—赖氨酸—赖氨酸—缬氨酸—丙氨酸（ADIVQGTCKKVA）。

该序列已经提交给SWISS-PROT数据库，注册号为P82817。

与数据库中已知的其他蛋白质没有同源性。

等电聚焦

等电聚焦实验表明法国梧桐花粉提取液主要由等电点范围在4.0至5.5的酸性蛋白和一条等电点高于9.3的碱性条带组成（图4）。

用单一过敏患者的混合血清进行等电聚焦—免疫检测，碱性条带显示出强烈的IgE活性，等电点在4.2至5.5范围之内的条带显示出微弱活性。

纯化的Plaa1的IEF（等电聚焦）结果表明等电点高于9.3的唯一条带能与单一过敏患者的混合血清结合（图4）。

图4.法国梧桐花粉提取液（泳道1，3和5）和纯化的Plaa1（泳道1和4）的考马斯亮蓝染色IEF（泳道1和2）和IEF—免疫印迹结果。

与法国梧桐花粉单一过敏患者（泳道3和4）和非过敏个人（泳道5）的混合血清孵育进行IEF—免疫印迹。

泳道M：

等电点蛋白标记。

抑制性实验

为了证明纯化的蛋白与粗提液中的一致，预孵育法国梧桐花粉单一过敏患者的混合血清和纯化的Plaa1进行免疫印迹抑制性实验。

Plaa1浓度大于2ng/ml时能完全抑制IgE与法国梧桐花粉提取液中的18kDa蛋白结合（图5）。

在以BSA为对照抑制剂的对照试验中未检测出抑制作用。

纯化的Olee1，油橄榄肌动蛋白抑制蛋白和Lolp1（20μg/ml）用于抑制多敏患者的混合血清来测定交叉反应的存在。

油橄榄肌动蛋白抑制蛋白抑制特异性IgE与14-16kDa条带结合，而与Lolp1和Olee1预孵育，对法国梧桐花粉提取液蛋白与IgE结合的抑制无明显作用（未显示数据）。

图5.法国梧桐花粉提取物的SDS-PAGE免疫印迹—抑制。

只与缓冲液（MonoB）或不同浓度的纯化的Plaa1和牛血清白蛋白（BSA）预孵育的单一过敏患者的混合血清。

实验讨论

虽然美国和欧洲的很多城市被报道空气中传播有大量的法国梧桐花粉，但是法国梧桐花粉症的发生并没有被普遍认识到[1-5]。

最近的研究报道在西班牙，对法国梧桐花粉呈现阳性SPT有很高的流行程度，范围从5%至56%[5-6]，不过对梧桐花粉的相关变应原还知之甚少。

在本研究中，我们描述了法国梧桐花粉提取物的性质并从花粉中提纯了主要变应原。

与法国梧桐花粉单一过敏和多敏患者血清孵育的SDS-PAGE免疫印迹图谱略有不同。

单一过敏患者的血清识别4种分子量为18、43、58和15kDa的变应原，但是只有18和43kDa蛋白质是主要变应原。

分子量为17和45kDa的IgE-反应蛋白是之前被报道的法国梧桐花粉变应原，虽然没有数据描述它们的生化或致敏特征[20-21]。

在EAST实验中，使用多敏患者的血清，油橄榄和黑麦草花粉花粉提取物能够部分抑制IgE与法国梧桐花粉的结合，说明这些提取物与梧桐花粉共享一些共同的抗原表位。

正如预计的，由于与草共敏化，抗Lolp1的特异性IgE抗体存在于多敏患者的血清中（未显示数据）。

通过与梧桐花粉过敏患者的血清进行ELISA抑制研究，先前已观察到对草的重要交叉反应[21]。

使用抗

Olee1兔血清和免疫印迹实验，在法国梧桐花粉提取物中没有检测到与Olee1反应的变应原，这表明检测到的交叉反应应归因于其他油橄榄变应原。

肌动蛋白抑制蛋白是树木、牧草和野草花粉中显著的变应原，并且被20%的花粉过敏患者所识别[22]，肌动蛋白抑制蛋白被称作泛变应原[21，23]。

与油橄榄肌动蛋白抑制蛋白进行的免疫印迹—抑制实验表明这种泛变应原与观察到的梧桐花粉交叉反应相关。

在这些实验中，油橄榄肌动蛋白抑制蛋白减少了IgE与13和15kDa的结合，这表明法国梧桐花粉提取物可能含有一些肌动蛋白抑制蛋白的异型体。

在一些植物的肌动蛋白抑制蛋白例如油橄榄树[16]、向日葵[14]和大豆[24]，已了解微异质性的存在。

因为一些已经定性清楚的植物肌动蛋白抑制蛋白的IgE反应频率总体而言非常低，所以观察到法国梧桐肌动蛋白抑制蛋白的普遍率为47%，出于利益和需要的目的，要进一步研究。

法国梧桐花粉中的18kDa蛋白，在梧桐花粉过敏患者中有87%的普遍率，称为Plaa1并且通过离子交换、凝胶过滤和反相色谱层析提纯。

粗提液和纯化的Plaa1与单一过敏患者的混合血清孵育进行IEF-免疫印迹显示出相似的图谱，因为法国梧桐花粉中另一主要的变应原，Plaa2的等电点也高于9.3（J.Ibarrola，未发表的结果），而且其他变应原（图4中非常微弱的条带的酸性等电点）在稀释混合血清后几乎消失了。

因为如图3（C）所示，反相色谱层析后的洗脱图表明当SDS-PAGE电泳显示出唯一的Plaa1条带时一个重要的高峰部分重叠，所以不能排除Plaa1异型体的存在。

而且，Plaa1的等电点大于9.3，是用于IEF的琼脂糖凝胶板的极限适用范围；

由于这个原因，所以不可能检测到符合Plaa1异型体的任何假定存在的条带。

在之前的研究中，Anfosso等人，报道了分子量为22kDa糖蛋白，命名为变应原P，存在于法国梧桐花粉提取物中，等电点为4.2[7，25]。

虽然这种蛋白作为主要变应原被报道并具有与Plaa1相近的分子量，但是本研究中提纯的变应原是一种未糖基化的碱性蛋白，这表明Plaa1和变应原P可能是不同的蛋白。

最近，报道了一种属于亲环素族的来源于桦树花粉（Betv7）的新变应原[19]。

该变应原的分子量为18kDa，等电点范围在9.0-9.3，与

Plaa1相似，但是正如最近研究中显示的结果那样，在Plaa1既没有检测旋转异构酶活性，也没有检测到与亲环素有同源性的N-末端氨基酸序列。

而且，仅基于Plaa1的N-末端序列与SWISS-PROT数据库的初步比较，未发现Plaa1与其他注册过的蛋白质有重要的同源性。

这些实验结果都说明法国梧桐花粉中的Plaa1可能是一种全新并且特有的变应原。

使用本研究中描述的由N-末端氨基酸序列衍生的特异性引物，通过mRNA的分离和编码变应原的cDNA的合成来进行阐明Plaa1完整序列和它与其他变应原之间同源性的研究。

在本文中，我们叙述了法国梧桐花粉中最相关的变应原，并且首次从法国梧桐花粉中提纯了主要变应原Plaa1，并对它的性质进行了鉴定。