中检院送检细胞制剂检定项目SOP.docx

中检院送检细胞制剂检定项目SOP.docx

《中检院送检细胞制剂检定项目SOP.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中检院送检细胞制剂检定项目SOP.docx（28页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

中检院送检细胞制剂检定项目SOP

中检院送检细胞制剂检定项目SOP

人脐带间充质干细胞P4代成品细胞质量标准

检测项目

检测方法

标准规定

【生物学属性】

细胞形态

镜检

细胞贴壁生长时，呈梭形，应为成纤维样细胞

细胞计数

细胞计数仪检测

标示量的90%～120%

STR图谱

多重PCR复合扩增系统检测

无交叉污染

细胞活率

细胞计数仪检测

不低于85%

细胞表面抗原分析

CD90

流式细胞术（FCM）

不低于95%

CD73

不低于95%

CD105

不低于95%

CD44

不低于95%

CD166

不低于95%

CD45

不得过2%

CD34

不得过2%

CD19

不得过2%

CD14

不得过2%

HLA-DR

不得过2%

【微生物学安全性检查】

无菌

需氧菌及真菌

全自动血培养仪监测

系统检测

阴性

厌氧菌及真菌

阴性

内毒素

凝胶法

阴性

支原体

培养法

阴性

逆转录病毒

PERT法检测逆转录酶活性

阴性

HIV-1

荧光PCR核酸检测

阴性

HBV

荧光PCR核酸检测

阴性

HCV

荧光PCR核酸检测

阴性

HCMV

荧光PCR核酸检测

阴性

EBV

荧光PCR核酸检测

阴性

HPV

荧光PCR核酸检测

阴性

人细小B19病毒

荧光PCR核酸检测

阴性

HHV6/7

PCR核酸检测

阴性

HTLV

PCR核酸检测

阴性

猪细小病毒

PCR核酸检测

阴性

猪细环病毒

PCR核酸检测

阴性

猪圆环病毒

PCR核酸检测

阴性

牛副流感病毒

PCR核酸检测

阴性

牛腺病毒

PCR核酸检测

阴性

牛细小病毒

PCR核酸检测

阴性

牛腹泻病毒

PCR核酸检测

阴性

牛呼肠孤病毒

PCR核酸检测

阴性

【生物学活性检查】

诱导分化能力检测

成骨成脂诱导分化染色法

具有成骨成脂诱导分化潜能

成瘤性检测

软琼脂克隆生长试验

无克隆形成

细胞流式检测标准操作程序

1目的：

对细胞表面抗原进行流式鉴定，保证检测的准确性。

2范围：

细胞流式检测的全过程

3责任人：

技术部

4内容

4.1仪器和试剂

4.1.1仪器设备：

流式细胞仪（FACSCaliburTM）、台式离心机、1000µL微量移液枪、100µL微量移液枪、10µL微量移液枪。

4.1.2试剂以及耗材：

FITC单克隆抗体、APC单克隆抗体、PE单克隆抗体、PerCP单克隆抗体、相应的同型对照；1XPBS；鞘液专用流式管、枪头。

4.1.3样本准备

4.1.3.1将样本按条码号顺序排列好，每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支，分别标记好单阳管、阴性管、同型对照管和样本检测管。

4.1.3.2各取100µL样本加入标记好的流式管中，然后根据流式管标记的信息分别添加对应的抗体。

充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟。

4.1.3.5孵育结束以后加入1mlPBS，充分混匀，1200rpm离心5分钟。

4.1.3.7弃上清液，加入300µLPBS。

充分混匀，随后上机检测。

4.2仪器开机程序

4.2.1依次打开稳压电源，主电源，流式细胞仪电源，计算机。

4.2.2开启电脑，在出现的密码登录框中，输入BDIS，按Enter。

4.2.3打开鞘液筒抽屉，检查鞘液筒和废液筒存液情况，鞘液筒空则需要加液，废液筒满则取出倒除，检查管路是否有气泡，否则应排除，没有问题以后，打开鞘液压力开关。

4.2.4开机后，仪器预热5min，即可开始进行实验。

4.2.5实验之前，仪器清洗，专用流式管装满双蒸水，放置仪器吸液管下，设备“run+high”情况下，然后PRIME（排空气）模式运行两次。

4.2.6流式细胞仪上样前FAScomp质控分析

4.2.6.1标准微球的制备（标准微球“CalBRITEbeads”保存4度）

三色检测：

管1：

1滴Unlabeled+0.5ml鞘液（或者0.5ml蒸馏水）

管2：

1滴unlabeled+FITC,PE,Percp各一滴+1ml鞘液

四色检测：

管1：

1滴unlabed+1滴APC+0.5ml鞘液

管2：

1滴unlabed+FITC,PE,Percp,APC各一滴+1ml鞘液

4.2.6.2打开FAScomp软件，在“sighin”窗口下，输入信息，然后“accept”,进入“setup”窗口。

4.2.6.3“setup”窗口下，选择分选模式：

“Lyse/wash”（用于溶血素洗涤样本）（通常选择该模式），“Lyse/Nowash”（用于溶血处理后的免洗样），然后输入CaliBRITEBeads”批号（批号为6位编码，最后一位为大写字母），选择存储文件。

4.2.6.4然后点击“RUN”，进入PMT窗口，在该窗口下，用管1为样品，选择“RUN-/high”。

点击“start”自动调节光电倍增管的电压，屏幕出现闪烁“PMTSsetsuccessfully”,点击“NEXT”。

4.2.6.5在“COMP”窗口下，用“管2”为样品，选择“RUN/HIGH”，点击“START”，可执行自动调节荧光补偿：

FL1-%FL2,FL2-%FL1和FL3-%FL2,屏幕出现“COMPENSATIONSETSUCCESSFULLY”便可点击出“NEXT”。

4.2.6.6在“sens”窗口下，依然用管2为样，点击“start”可自动检测各参数灵敏度。

4.2.6.7在“summaryreport”下得到所有检测的结果。

4.2.6.8质控完成后，移去标准微球管并插上双蒸水流式管，在“summaryreport”状态下，点击“quit”键，或从“filemenu”中选择“quit”退出程序。

4.2.7打开cellquestpro软件，按”common+B”组合键，连接流式细胞仪。

4.2.8从“cytometer”菜单中选择“detectors”（或者键盘“common+1”）、“threshold”（或者“common+2”）、“compensation”（或者键盘“common+3”）、“status”（键“common+4”）,将出现各自对应的窗口，将其拖至空白处。

4.2.9确定软件与细胞仪完成连接。

如果有必要，可点击Cytometer视窗，观察软件与细胞仪是否完成连接。

4.2.10完成连接后，在Cytometer视窗下方会显示CytometerConnected。

检视各项试剂液面是否正常。

在Cytometer视窗右下方会显示各项试剂液面高度。

视实验需要补充FACSFlow，倒除废液。

如果视窗下方显示CytometerDisconnected，可尝试重新启动Cellquestpro软件。

4.2.11接着可以开始规划实验挡、或设置仪器。

4.3上样检测

4.3.1在工具板中选择点图，在文件的空白区点击，然后拖动对角线至所需大小，出点图对话框，点击“plottype”,选择“acquisition->analysis”；X、Y轴默认为FSC、SSC，然后上阴性管，调节FSC、SSC电压，再设置目标细胞群“region”，该“region”在调节荧光探测器时使用，在工具板中选择多边形“region”，在FSC/SSC散点图上，设淋巴细胞“region”，该“Region”在调节荧光探测器时使用；在工具板中选择多边形的“Region”,在FSC/SSC点图上，设目标细胞群“region”,在“region”外点击，将拖至空白区。

然后建立FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,选择“G1=R1”,在工具板上选择象限标尺，三个点图上画象限，指定阴性/阳性区域，调节FL1、FL2、FL3、FL4电压，使细胞群调在各点图所在图的左下角，点击“Acquisitioncontrol”窗口中的“pause”,移去阴性对照管。

4.3.2依次上FITC、PE、Percp、APC单阳管，必要时，调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL2-%FL3、FL3-%FL2、FL3-%FL4、FL4-%FL3的补偿，调节完成后，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,移去单阳管。

4.3.3插上同型对照管，删除FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,建立FL1、FL2、FL3、FL4直方图，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”，之后Setup之面方框‘√’去掉，然后点击‘Acquire’,收集10000个细胞，然后同型管图型外阳性区域画直方图Marker,设定Marker左右边界，移去同型对照管。

4.3.4插上样本检测管，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,之后Setup之面方框‘√’去掉，然后点击‘Acquire’，收集10000个细胞，结束以后，移去样本管，插上双蒸水管，将仪器处于“standby”状态。

4.3.5分析数据，选中一个图表，点击菜单中stats，选择“HistogramStats”,出现该选中图的数据分析结果，选择Stats菜单下的“EditHistogramStats”，出现对话框，去掉一些不需要的参数，点击OK。

4.3.6数据储存，首先在Cytometer视图菜单下选择InstrumentSetting保存数据条件，然后Files视图菜单下选择saveDocumentas保存数据模板，之后可使用相关软件进行数据分析。

4.4仪器关机程序

4.4.1换上双蒸水管。

4.4.2在High+Run条件下，运行3min，2次，然后PRIME+high进行排空气2次。

4.4.3点选File>>Quit退出软件。

关闭细胞仪，关闭电脑。

如有必要，请加入1/10体积

漂白水，再倒掉废液，避免生物性危险。

4.4.4填写运行记录。

5修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人/修订日期

支原体培养法检测标准操作程序

1目的：

规范培养法检测支原体的标准操作程序

2范围：

细胞产品中支原体的检测

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验试剂耗材

4.1.1仪器：

生物安全柜，二氧化碳培养箱，电动移液器，移液枪

4.1.2耗材：

EP管，200µl枪头，5ml移液管，15ml离心管

4.1.3试剂：

支原体培养法检测试剂盒

4.2实验步骤

4.2.1用5ml移液管取细胞培养上清于15ml离心管中备用。

4.2.2取出试剂盒的测试板准备种样本，移液枪吸取100ul培养液加入A1-空白对照孔。

4.2.3将100ul细胞培养上清加到UU-MH培养瓶中，混匀。

4.2.4吸取100ulUU-MH培养瓶中的混合液体分别接种到样本检测的微孔中，所有微孔滴加1-2滴试剂盒中的矿物油。

4.2.5将测试板加盖后置培养箱中35-37℃培养24-48小时，观察结果：

接种标本的培养基培养后，澄清透明不变色为阴性，澄清透明并呈明显红色为阳性。

4.2.6若偶遇培养基变浅红色（即变色不明显），建议延长12~24h培养报结果（可能刚感染支原体，标本中支原体数量过少或受抗生素抑制作用而使变色不明显）。

5记录

5.1试剂盒的支原体鉴定报告单

6修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人/修订日期