中国农业大学考博基因工程Word文件下载.docx

中国农业大学考博基因工程Word文件下载.docx

《中国农业大学考博基因工程Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国农业大学考博基因工程Word文件下载.docx（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

存在于根瘤土壤杆菌细胞中的一种大型的DNA质粒，它控制根瘤的形成。

Ti是英文（Tumor-inducing）的略语。

Ti质粒现已改造成为植物基因工程的最重要的载体系列。

8.YAC：

Yeastartificialchromosome,它是利用酵母染色体的着丝粒和端粒元件，人工构成的能够在酵母细胞中增殖并能转移到哺乳动物细胞的遗传元件。

这类载体能够将200－1000kb上的DNA遗传物质导入寄主细胞，YAC现已被用来研究大的遗传座位，例如人11号染色体的β－球蛋白区段的生理调节作用。

9.染色体步测：

chromosomewalking，一种用来鉴定一系列彼此重叠的DNA片段的分子生物技术，通常被用来测定在DNA大分子中各个基因的相关位置。

10.粘性末端：

cohesiveends或stickyends：

酶切位点在两条DNA单链上不同，（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。

11.平末端Bluntend：

酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。

12.溶源现象：

噬菌体感染细菌后并不马上复制引起寄主裂解，而是将自身的DNA整合在寄主染色体上，随寄主染色体一起复制，这种现象称为溶源现象。

13.转导：

transduction，以病毒为载体（对细菌而言是噬菌体）把遗传物质从一种细胞转移到另一种细胞的过程。

14.转染：

transfection,

（1）应用从病毒或病毒载体中分离的DNA或RNA感染细胞的过程

（2）真核细胞捕获外源DNA并通过参入作用而获得新的遗传信息的过程。

15.转化：

transfomation,

（1）细菌的转化指细菌捕获游离DNA，并使此DNA编码的遗传信息导入细菌染色体中成为永久性遗传组成部分。

（2）正常的真核细胞由于受到致瘤病毒的感染而转变成恶性细胞的过程也叫转化。

（3）目前认为，凡外源DNA导入细胞的过程都可以称为转化。

7、自然条件下的转化只发生在细菌生长的一个特殊阶段,称为感受态（Competence）。

在这一阶段,它们能够吸收外源分子。

16.同裂酶：

能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。

同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。

有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用以研究DNA甲基化作用。

17.同尾酶：

isocandamers,识别的靶序列不同，但能产生相同的粘性末端的一组限制性内切酶。

18.同位酶：

isoschizomer,识别位点相同的一组限制性内切酶，所产生的粘性末端不一定相同。

19.限制性内切酶:

Restrictionendonudeases,是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

在细胞内这类酶的功能是保护细胞免受外源DNA的侵扰，又称限制酶，分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，但其中只有Ⅱ型酶在基因工程中具有重要实用价值。

20.核酸外切酶：

exonuclease，从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解核苷酸链。

21.Kleknow片段:

大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性.主要用途:

A.修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端,B.标记DNA片段的末端,C.cDNA克隆中第二链cDNA的合成,D.DNA序列的测定

22.脉冲电场凝胶电泳：

1984年，Schwarte和Cantor发明了脉冲电场凝胶电泳技术（PFGE），

在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向是随着所用的电场方向的周期性变化而不断变化的。

在标准的PFGE，头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向或45度夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧变成45度夹角。

由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变换着，这就使得DNA分子能随时地调整其活动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。

与分子量极小的DNA分子相比，分子量较大的DNA分子需要更多的次数来更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。

因此，在琼脂糖介质中的迁移速率也就变得更慢一些，从而达到分离超大分子量DNA目的，可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的DNA分子（高达107bp）

23.细菌人工染色体（BAC）：

指一类以T-质粒为基础构建的基因克隆载体，用来在大肠杆菌中克隆分子量较大的外源DNA片段。

24.单链构象多态性：

是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链的电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失的检测。

用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表达为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无突变或多态性的优点，但如要阐明突变的碱基性质，则需进行序列分析。

25．一个酶单位（U）指：

在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，

50L反应体系中完全降解1gDNA所需要的酶量。

26.亚克隆是指用最初克隆的DNA片段的不同部位，再分别进行克隆。

27．回收者载体就是利用酵母的整合型质粒作载体，将染色体上发生天然突变的基因置换到质粒上，然后从酵母细胞中提取这种质粒，以达到分离和研究突变基因的目的。

28.缺口平移：

nicktranslation,在离体试验中，由于DNA聚合酶I的聚合酶活性和5’－3’外切酶活性的同时作用，使双链DNA上的切刻沿着5－3的方向由一个位置平行移动到另一个位置，这一作用和过程称为缺刻平移。

29．Rnase保护：

利用32P放射法或生物素（非放射法）标记由多目标基因DNA模板体外转录出的长短不一的反义RNA探针，将标记的寡核苷酸探针与细胞总RNA或mRNA杂交，再用Rnase酶活化单链未杂交的DNA，则杂交的双链被保护不被Rnase酶活化。

30．DNA：

DNA（脱氧核糖核酸）是几乎所有生物遗传信息的携带者，不但携带着基因的编码信息，而且还贮存着基因选择性表达的指令。

从结构上来说是脱氧核糖核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键连接而成的高聚物。

31.细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。

质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。

最常用的质粒是pBR322。

32.噬菌体（phaeg）噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。

用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。

33.黏性质粒（cosmid）是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。

34.表达型载体将细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。

　　将外源真核基因插入在特殊设计的载体上，使之置于原核表达信号的控制之下，从而能够在大肠杆菌细胞中正确地转录和翻译，并表达出外源蛋白质，这样的克隆载体，称为表达载体。

二、简答题

1．什么是转座子？

以玉米和拟南芥为例说明转座子标签法分离、克隆基因的原理及应用？

答：

转座子是可以从基因组的一个位置转移到新位置的DNA序列。

植物转座子最早是由B.McClintock在玉米中发现的，之后，人们在大肠杆菌、果蝇以及金鱼草等许多生物体中也相继找到了转座子。

转座子的插入作用使被插入的目的基因发生突变失去活性，而转位子的删除作用又使目的基因恢复活性。

根据转座子的这种特性发展出的分离基因的新方法，叫做转座子标签法。

这些导入新寄主的外源转座子，仍具有良好的转位活性，为分离植物基因提供了有用的工具。

具体步骤：

首先使使转位子在适宜的条件下转位插入到目的基因序列中，，接着用已知的转座子序列作探针，分离因转位子插入而发生了突变的目的基因，最后以突变基因中包围转位子的侧翼序列为探针分离野生型的目的基因。

　　玉米是最早发现转座子并被首先克隆的高等植物，玉米转位于除了Ac/Ds系统之外，还有En/Spm系统。

Ac的转位插入作用，可导致蜡质（Waxy）基因发生突变，故被用来分离玉米的蜡质基因，这是通过转位子标签法分离的第一个重要的植物基因。

2．试举出2-3种研究基因组测序或功能基因的技术和策略。

（1）基因组测定：

A.Sanger双脱氧终止DNA测序法。

原理：

利用了DNA聚合酶具有两种酶促反应的特性，第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA做模板，合成出准确的DNA互补链，第二，DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之渗入到寡聚核苷酸链的3’末端，从而终止DNA链的生长。

通过将一段待测的DNA片段克隆到M13噬菌体或其衍生载体上而得到，DNA的合成由一个通用引物开始，该引物与M13的多克隆位点区相邻的区域互补，DNA序列分析的体外合成反应一般是在4个试管中分别进行的，每个试管中都含有一种ddNTP，反应底物dNTP中还要含有一种放射性标记的核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA模板链的互补链，并随机地渗入双脱氧核苷酸，使DNA延长终止。

因此每个反应中就产生了一套长短不同的放射性标记的单链DNA片段，将4种反应混合物在变性条件下进行高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射性自显影，就可以读出被测定的DNA片段的核苷酸序列。

B.Maxam-Gilbert化学修饰法

用化学试剂如硫酸二甲酯和肼，处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由上产生的一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳按大小分离，放射自显影后，便可根据X光片底片上所显现的相应谱带，直接读出待测的DNA片段的核苷酸序列，用这一方面进行核苷酸序列测定，首先要制备末端标记（通常有放射性P32进行标记）的单链DNA，可以用多核苷酸酶将磷酸引入双链DNA的5’末端，再用限制性内切酶从一端切掉一小段并将切下部分除去，就得到了放射性标记的单链DNA。

用适当的化学试剂（如硫酸二甲酯或肼）处理标记的单链DNA，使标记的DNA在4种核苷酸中的一种核苷酸处断开，这样就得到了从放射性标记物到DNA链中每个特异性核苷酸处的各种长度的DNA片段群体。

经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，就可以将不同长度的相差为一个核苷酸的DNA片段分开。

C．杂交测序法：

如果一段较短的DNA探针能够同较长的靶DNA片段杂交，并形成完全双链DNA分子，那么我们就要以据此推断在靶DNA上存在着相应的互补序列。

这就是DNA杂交测序法原理。

包括两个步聚：

首先将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交，然后对那些能够同靶DNA形成完全双链体分子的寡核苷酸探针之间的碱基互叠关系进行比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列结构。

3.PCR与RAPD的区别？

（1）引物，经典的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20个bp左右，RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。

（2）反应条件，经典的PCR反应复性温度较高，一般为55-60度，而RAPD的复性温度仅为36度左右。

（3）扩增产物，经典PCR产物为特异性扩增，而RAPD产物为随机扩增。

AP-PCR：

利用一个或两个短的富含GC碱基的随机引物，在AP-PCR分析中，扩增分为三步，每个部分要求条件和组分的浓度存在差异，在第一个PCR循环中，引物的浓度较高，引物长度不定，并且常常是为其它目的而设计的引物。

AP-PCR测定是用一段短的随机合成的寡核苷酸（约10-20bp）做引物，与DNA杂交后加以扩增，由于细菌不同类型之间在DNA全长上的少数差别而得到不同长度的片段，最后根据电泳条带的数目和分子量差别对同种细菌分型（由于PCR技术的敏感性，其应用日益增多，对细菌检测可达106个菌中只含10个靶细菌的敏感度）

4．DNA芯片种类及机理？

DNA芯片技术是在Southern杂交技术的基础上发展起来的，它利用核酸杂交原理检测未知分子，将核酸片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成密集的分子探针排列，制成芯片。

杂交后通过激光激发探针或靶分子上的荧光系，放出的荧光信号被检测器及处理器处理，从而得知分子杂交情况。

按探针的类型不同，DNA芯片主要包括：

cDNA芯片和寡核苷酸芯片以及Genomic芯片。

DNA芯片机理同SBH，即任何线状的单链DNA（或RNA）序列均可被分解为一个序列固定、错开而重叠的寡聚核苷酸，又称互序列。

互序列中ATCG4个碱基自动组合而形成的所有可能的序列共有48种（例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分为5个8个碱基型序列，这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基），假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。

可以用人工合成的已知序列的所有可能的寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过杂交信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型数据进行分析，生物靶DNA的互补寡核苷酸序列。

应用：

（1）基因表达水平的检测；

（2）基因诊断；

（3）药物筛选；

（4）个体化医疗；

（5）测序；

（6）生物信息学研究。

5．论述功能基因组研究的策略？

功能基因组学研究，又称后基因组学研究，它是利用结构基因组提供的信息和产物，通过在基因组和系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从单基因或蛋白质的研究转向多基因或蛋白质同时进行系统的研究。

功能基因组学的研究包括基因功能发现，基因表达分析及其突变检测。

它主要采用比较基因序列和测定基因组序列两大类方法力图从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。

（1）通过比较基因序列获得有关基因功能的信息

A：

表示序列标识（EST）法：

这种方法是鉴定和发现表达基因的最快途径，主要是通过对随机挑选的cDNA从一端或两端进行长为300-500bp的测序，建立这些序列的数据库，在还不能对大基因组的植物进行全序列测定的情况下，EST法是一种高速有效的功能基因组学研究方法。

B：

模体结合直系同源体簇的分析方法：

此方法首先用进化分析方法把基因家族划分为直系同源族，然后构建家族及各个直系同源簇的特异模体，借助已有的生物系串簇形成功能模体库，每一个未知基因产物的功能可以通过探索该功能模体库而得以高效准确地生成。

（2）通过测定基因组序列确定基因的功能

基因表达连续分析法（SAGE），其主要依据是：

如果一段9bp长的序列来源于所有被检测基因的同一位置，则这段序列可以区别49个基因。

从转录本cDNA的特定位置（靠近3’端）以锚定酶和位标酶进行酶切，分离出短核苷酸序列（9-10bp），它包含了能代表该转录本的足够信息。

将一个体系的所有转录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测序，每个位标出现与否以及位标出现的概率将代表某一基因是否表达以及表达的水平。

通过比较不同组织的同一发育时期，同一组织的不同发育时期或健康及病理状态下的SAGE位标，可以进一步克隆与发育相关的基因。

SAGE方法已经应用于人类和酵母基因组的研究。

微阵列或DNA芯片法：

是由美国Stanford大学Brown小组建立的方法，它将几万个寡核苷酸或DNA密集排列于硅片等固体支持物上做为探针，把要研究的样品标记后与微点阵杂交，用激光共聚焦显微镜或其它设备对芯片进行扫描，根据杂交信号强弱及探针位置和序列确定靶DNA的表达、类型以及关系和多态性的存在。

1995年Schenn等人推出了一种更有效的方法：

把DNA微阵列高密度地固定在预处理过的玻璃载体上作为探针检测未知DNA或RNA，即使丰度为105分之一也可以检测到。

（3）蛋白质组法：

蛋白质组的概念是由Wilkins和Willians（1994）年提出来的，当时包括“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”，蛋白质组分析法首先利用双向电泳技术分离蛋白质组分，然后利用专门的计算机软件对所得图像进行数据采集和分析，从胶上回收蛋白质并采用氨基酸组成分析，微量蛋白质序列分析，质谱分析等技术进行鉴定，从而获得蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如分子量、等电点和表达量等。

将获得的数据与已知蛋白质数据库中的数据进行比较，就可以知道某序列编码哪种蛋白质，从而建立起一个生物特异的全蛋白质数据库。

目前，它已在流感嗜血杆菌、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇以及人类等的基因组研究中应用。

（4）在获得功能表现型突变体之后研究该基因的表型：

通过插入突变建立突变体库，转座子或根癌杆菌T-DNA插入都可以造成功能表现型突变，把报告基因与突变体结合在一起，用于鉴定基因在插入位点的表达，从而筛选特殊细胞类型和特殊环境条件下表达报告基因的株系，从中分离具有特定表达类型和启动子的基因。

6．提高外源基因表达的原理和技术？

（1）构建最适合的启动子。

受检测启动子的强弱与它们和一致性序列相似的程度成正比。

进一步的研究表明，-35和-10区域之间的距离也是一个重要因素。

如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强；

如果大于17个碱基对，启动子表现较弱。

（2）使翻译起始尽可能完善。

在DNA上除了AUG这一翻译的起始密码子外，还有大约三种结构与翻译起始有关：

（a）S-D序列，它含有5‘UAAGGAGGU3’的全部或部分多聚嘌呤的序列；

（b）对于编码高效表达的蛋白质（如噬菌体衣壳蛋白质和核糖体蛋白质）的基因，它们的核糖体结合位置含有全部或部分PuPuUUUPuPu序列；

（c）在核糖体结合位置上，可能有1个或更多的终止密码子，至少对于多顺反子的情况是如此。

另外：

（d）曾经做过这样一个实验，发现在S-D序列后边的碱基是4个A或4个T，翻译效率最高；

如果是4个c或4个G，翻译效率分别是最高值的50％或25％；

（e）紧挨着AUG密码子的前边一个三联体密码子成分也会影响翻译效率。

（3）密码子的选择。

密码子的选择与细胞中tRNA的可利用性相关。

tRNA的丰富程度与密码子中选率明显地正相关。

在嘧啶结尾密码子中，对第三位上嘧啶的非随机选择：

a.遗传分析表明，三联体密码X1X2C和X1X2U总是编码同样的氨基酸。

b.一般地讲，这两种三联体密码是由同种tRNA译码的。

但tRNA对这种密码子第三位置上的嘧啶的选择，可能有一种偏向，而这种偏向是与基因的表现度（geneexpressivity）相关的。

c.在高效表达基因中，如果三联体密码子中前两个碱基是A或U，那么C是有利的第三个碱基；

如果前两个碱基是G或C，那么第三个碱基为U才是合适的。

（4）在启动子与结构基因间安排合适的距离。

（a）翻译的起始点和S－D序列必须接近到一定程度；

（b）翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5‘末端区域间的互作，

（5）转录的终止。

克隆基因的末端必须要有转录终止区，如果没有它，其缺点如下：

（a）转录物不必要的加长，增加了细胞能量的消耗，产生大量无用的蛋白质；

（b）转录物可能形成不理想的二级结构，从而降低了翻译的效率；

（c）可能发生启动子堵塞的现象，也就是从克隆基因的启动子开始的转录可能干扰另一个重要基因的转录。

（6）提高质粒的copy数及其稳定性。

通过使用高拷贝的质粒载体，如PBR322，都会提高外源基因的表达量。

但宿主细胞的遗传背景同时会影响质粒的拷贝数，随着重组体克隆基因表达水平的上升，宿主生产率便相应下降，同时会产生某种突变而失去重组质粒，或经过结构重排使重组基因无法表达，这就是质粒的不稳定性，如果构建的质粒同天然质粒一样有一段分配功能区Par区，就能够保证质粒分子的稳定性。

（7）寄主细胞的生理状态。

影响生理状态的因素包括营养的选择、培养方式和环境参数如温度（25-30度）、可溶性氧气压等等。

7．举例说明两种植物转基因方法，并说明其原理。

（1）农杆菌介导转化法：

农杆菌是普通存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位。

并诱导产生冠瘿瘤或发状根，根瘤农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T－DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T－DNA插入到植物基因组中，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T－DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

在获得了具有外源基因插入的质粒共生体或双元载体的农杆菌后，要转化植物细胞，用叶盘转化法：

将叶子表面消毒后，用打孔器取下圆形小片即叶盘，然后接种上含用重组Ti质粒的农杆菌。

在饲养的滤纸上培养两天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的抗生素的长芽培养基中，进行筛选和再生，接着再转移到生根培养基上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽到土壤中，对长出的小植株进一步进行鉴定，如Southern杂交和Northern杂交，即可以检测出是否含有外源目的基因。

农杆菌介导法最初只应用于双子叶植物，近年来，在一些单子叶植物上也得到广泛应用。

（2）基因枪介导转化法：

利用火药爆炸或高压气体加速（基因枪），将包裹有目的基因DNA的微粒群（金粒或钨粒）直接送入到完整的植物组织、愈伤组织和细胞中，