基因工程药物研发的基本过程Word文档格式.docx

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对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。

为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。

一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。

通过这种方法可大大减少由载体的自

环造成的高本底。

对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。

双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

TaqDNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-TEasyVector末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

二．材料与方法

1材料

外源DNA片断

2仪器、用具

移液枪、碎冰

3试剂

pMD18-TVector；

Ligationbuffer；

T4ligatease；

rATP

4方法

连接体系如下：

16℃连接过夜。

（二） 

重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

E.coliJM109菌株

超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器

（1）CaCl2、LB平板（见附录）；

SOC培养基（见附录）；

SOB培养基

（2）RNaseA1；

BufferS1；

BufferS2；

BufferS3；

BufferW1；

无水乙醇的BufferW2a

（3）1×

电泳缓冲液（TAE）；

溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；

琼脂糖；

6×

加样缓冲液

（4）酚；

氯仿；

异戊醇

（5）ddH2O；

10×

PCRBuffer（Mg2+plus）；

dNTP；

M13+；

M13-；

TaKaRarTaq酶

1.大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4mlLB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4mlLB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。

（2）4℃，5000rpm离心2min，去上清液。

（3）加入750μl预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，冰浴30min。

（4）4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

（5）加入100μl冰冷的0.1MCaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。

2.重组DNA的转化

（1）将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

（2）于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。

（3）将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。

（4）在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。

（5）将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。

注意事项：

①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。

②42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。

③菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

3．重组质粒的鉴定

方案一菌落PCR

（1）制备PCR混合液：

（2）用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中

（3）盖上离心管得盖子，在沸水上温育10min。

（4）将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。

（5）按以下条件进行PCR反应：

94℃预变性3min；

然后进行30个循环反应，其温度循环条

件为：

94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；

循环结束后72℃再延伸5min。

（6）取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

方案二质粒PCR

1.碱裂解法少量制备质粒DNA

（1）用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。

（2）用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。

（3）加入250μlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。

*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。

（4）加入400μlBufferS3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。

*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。

（5）将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。

（6）弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。

（7）弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer

W2洗涤一次。

（8）弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm离心1min。

（9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prepTube置于一新的1.5ml离心管中，在silica膜

中央加入25-30μlEluent或去离子水。

（10）室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。

（11）取5μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。

2.抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

（1）加TE稀释质粒DNA溶液至300μL。

（2）加等体积的酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1），震荡混匀，静置3min。

（3）14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的酚:

1），混匀，静置3min。

（4）14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:

异戊醇（24:

（5）14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，沉淀质粒DNA。

（6）14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200μL70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。

（7）取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

3.质粒PCR

（1）PCR反应体系如下：

（2）PCR扩增反应条件：

然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：

（3）取5μlPCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。

PCR产物克隆大致分为两类，平滑末端连接和粘性末端连接，平滑末端比粘性末端的连接效率要低很多。

平滑末端连接：

载体为平末端，可用EcoRV或SmaI酶切，同时为了防止载体自连，对载体做了去磷酸处理。

PCR产物为磷酸化的平末端产物：

一般高保真聚合酶扩增得到，高保真聚合酶有很强的3’→5’外切酶活性。

或将非平末端的PCR产物使用DNA聚合酶进行平末端处理。

对于平末端的PCR产物还需要进行磷酸化处理，使其5’磷酸化。

粘性末端连接：

1、酶切克隆：

在PCR引物的5’端引入与载体匹配，不同识别位点的限制性酶切位点，载体使用同样的限制性切酶酶切，进行连接，通常可以得到定向克隆的结果。

2、TA克隆：

TA克隆系统由Invitrogen公司（SanDiego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。

其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

TA克隆没有方向性。

聚合酶链式反应

科技名词定义

中文名称：

英文名称：

polymerasechainreaction;

PCR

定义1：

用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。

所属学科：

生态学（一级学科）；

分子生态学（二级学科）

定义2：

体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。

水产学（一级学科）；

水产生物育种学（二级学科）

定义3：

通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。

细胞生物学（一级学科）；

细胞生物学技术（二级学科）

定义4：

由穆利斯（K.B.Mullis）于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。

遗传学（一级学科）；

分子遗传学（二级学科）

本容由全国科学技术名词审定委员会审定公布

目录[隐藏]

[概述]

［PCR原理］

[PCR反应体系与反应条件]

1.1.标准的PCR反应体系

2.2、PCR引物设计

3.3、模板的制备

4.4、PCR反应条件的控制

［PCR步骤］

1.1.DNA变性

2.2.退火

3.3.延伸

［PCR检测］

［PCR反应特点］

1.特异性强

2.灵敏度高

3.简便、快速

4.对标本的纯度要求低

［PCR的循环参数］

1.1、预变性（Initialdenaturation）

2.2、循环中的变性步骤

3.3、引物退火（Primerannealing）

4.4、引物延伸

5.5、循环数

6.6、最后延伸

[PCR仪器]

PCR实验室的建立方法

1.1、实验室布局

2.2、设置标准

3.

（一）试剂储存和准备区

4.

（二）标本制备区

5.（三）基因扩增区和产物分析区

[概述]

［PCR原理］

［PCR检测］

[PCR仪器]

∙PCR实验室的建立方法

[编辑本段]

　　聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

可看作生物体外的特殊DNA复制。

　　DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow

PCR流程

fragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。

现今所使用的酶（简称Taqpolymerase）,则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。

他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。

而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。

Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。

此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。

随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。

Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

　　发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

[PCR反应体系与反应条件]

1.标准的PCR反应体系

扩增缓冲液

10μl

4种dNTP混合物

200μl

引物

10～100μl

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶

2.5μl

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水

100μl

　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即:

　　引物（PCR引物为DNA片段，细胞DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

　　引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。

但基本原则相同

　　PCR所用的酶主要有两种来源：

Taq和Pfu。

分别来自两种不同的噬热菌。

其中Taq扩增效率高但已发生错配。

Pfu扩增效率弱但有纠错功能。

所以实际使用时根据需要必须做不同的选择

　　模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制

　　缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：

缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；

一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；

辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构

2、PCR引物设计

　　PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；

3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

　　引物设计的基本原则

　　①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　③引物部不应出现互补序列。

　　④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。

　　⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

　　⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

　　⑦引物的5′端可以修饰。

如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

　　v引物设计软件

　　PrimerPremier5.0（自动搜索）*

　　vOligo6（引物评价）

　　vVectorNTISuit

　　vDNAsis

　　vOmiga

　　vDNAstar

　　vPrimer3（在线服务）

3、模板的制备

　　PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

　　模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

　　标本处理的基本要除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

4、PCR反应条件的控制

　　①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子

　　②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L

　　③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L

　　④TaqDNA聚合酶2.5U（100ul）

　　⑤引物浓度一般为0.1～0.5umol/L

　　⑥反应温度和循环次数

　　变性温度和时间95℃，30s

　　退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃

　　延伸温度和时间72℃，1min/kb（10kb）

　　Tm值=4（G+C）＋2（A+T）

　　循环次数:

一般为25～30次。

循环数决定PCR扩增的产量。

模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。

一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

［PCR步骤］

　　标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性

　　（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火

　　（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸

　　（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

如图所示：

　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

　　PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。

荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。

电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂