菌种保藏与管理文档格式.docx

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5）中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）。

6）抗菌素菌种保藏管理中心（CACC）。

7） 

中国普通微生物菌种保藏管理中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC）。

2、国外的菌种保藏机构

1）美国典型菌种保藏中心ATCC（AmericanTypeCultureCollection） 

2）日本技术评价研究所生物资源中心NBRC（NITEBiologicalResourceCenter）NBRC（IFO）。

3）美国农业研究菌种保藏中心NRRL（AgriculturalResearchServiceCultureCollection）。

4）荷兰微生物菌种保藏中心CBS（CentraalbureauvoorSchimmelcultures） 

。

5）韩国典型菌种保藏中心KCTC（KoreanCollectionforTypeCultures）。

6）德国微生物菌种保藏中心DSMZ（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen）。

7）英国国家菌种保藏中心UKNCC（TheUnitedKingdomNationalCultureCollection）。

8）英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心NCIMB（NationalCollectionsofIndustrial,FoodandMarineBacterial）。

第二节常用菌种保藏方法

一、菌种保藏的原理

微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。

影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。

1、营养物浓度

营养太低时，细菌生长就受到阻碍，甚至还会死亡。

这是因为除了生长需要能量以外，细菌还需要能量来维持它的生存。

这种能量称为维持能。

另一方面，随着营养物浓度的增加，生长率愈接近最大值。

碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水是常见的六大类营养物质。

2、温度

在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：

最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。

在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。

微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。

超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。

超过最高生长温度，微生物也要停止生长。

温度过高，也会死亡。

一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。

但也常受其它环境条件的影响而发生变化。

3、水分

水分是微生物进行生长的必要条件。

芽孢、孢子萌发，首先需要水分。

微生物是不能脱离水而生存的。

但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。

各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。

4、氧气

按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。

（1）需氧微生物这类微生物需要氧气供呼吸之用。

没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。

很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。

绝大多数微生物都属于这个类型。

（2）兼性需氧微生物这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。

在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。

（3）微量需氧微生物这类菌是需要氧气的，但只在0.2“个”大气压下生长最好。

这可能是由于它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。

（4）耐氧微生物这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。

（5）厌氧微生物这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。

分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。

菌种保藏的原则是根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。

低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。

因此低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。

选择保藏方法时，首先应当考虑方法能否长期的保持菌种原有的特性，同时也应当兼顾到方法的经济和简便。

在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏的效果。

菌种保藏的效果是指菌株保存活性，避免污染，同时没有基因型和表性特征的改变。

二、常用的菌种保藏方法

菌种保藏分四个阶段：

①挑选特征典型的纯菌菌落；

②确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽孢的代谢作用较弱，同时对恶劣环境有很强的抵抗力，因此对凡能产生孢子或者芽孢的微生物都用孢子和芽孢进行保藏；

③选择最适宜的保藏方法进行保藏；

④定期对保藏的菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。

保藏期满应及时进行移种。

菌种保藏按照保藏时间的长短可以分为短期保藏方法和长期保藏方法。

短期保藏方法包括直接传代保藏，油浸法，-20℃保藏，干燥和蒸馏水保藏法。

长期保藏法包括超低温保藏法和冻干保藏法。

下面介绍一些具有代表性的菌种保藏方法。

1、直接传代保藏法

（1）方法：

将经常使用的菌种的典型菌落接种在营养琼脂斜面（或蒸馏水、营养肉汤等培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发（最好采用带有螺帽的菌种管、管帽盖最好有橡胶垫或膜以保持干燥），延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成无菌橡胶塞。

收存4℃左右的冰箱中保藏。

每隔2～3个月移种一次，继续进行保藏。

若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年至一年。

有的甚至更长时间。

（2）适用范围：

本法适用于经常使用的细菌、酵母菌、放线菌和霉菌保藏。

（3）特点：

此法为实验室和生产企业保藏菌种的常用方法，优点是简便，易于推广；

一般不需要另选择保藏用培养基；

对大多数微生物都适用。

此法缺点是保藏期太短；

传代次数多，易发生变异和污染。

2、液体石蜡保存法

本法是传代保藏法的一种改进方法，用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低需氧菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。

①将菌种接种于斜面或穿刺于半固体高层培养基中，培养好备用。

②取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10～15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110～170℃烘箱中1～2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

③将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面高出培养基最上端lcm为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保存。

本法适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差，对于某些能同化烃类的微生物也不宜使用。

本法对各类菌种保存效果见下表。

表中数据表明，液体石蜡法对细菌的保藏效果最差。

据报道不适于用本法保藏的细菌和真菌有：

固氮菌、乳杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌、沙门菌、布拉霉菌、丝枝霉、卷霉、小克银汉霉、根霉、毛霉等丝状真菌。

一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

（3）特点：

本法简便易行，不需要特殊设备，是实验室常用的一种保藏方法。

该法主要使菌种与空气隔绝，根据同样的道理，用橡皮塞代替棉花塞，也能达到隔绝空气的目的。

这种方法可用于保存酵母菌，一般可保存l至数年。

为越来越多的实验室保藏菌种所采用。

3、沙土管保藏法

本法系将待保藏菌种的新鲜培养物，菌悬液，滴加在灭菌的沙土管中，使菌体或孢子依附在沙粒上混匀再干燥保藏。

①制备沙土管：

取过40目的河沙和过100目的贫瘠黄土若干，分别用10％的稀盐酸浸泡4h后煮沸30min，以除去有机质。

若有机质较多，可用20％盐酸浸泡。

倒去盐酸，用水反复冲洗至pH中性后，再用蒸馏水浸洗1～2次．然后烘干。

将沙和土按4：

1比例混合、拌匀，分装于小试管或安瓿管中厚约lcm，塞好棉塞，121℃灭菌50min。

取灭菌后的沙土粒少许，一般每10支抽1支接种在营养肉汤、麦芽汁或者豆芽汁等培养基中，并经检查无菌生长者方可使用。

如有菌生长，须重新灭菌，经试验合格后方可使用。

②混合菌液：

取保藏菌种的新鲜培养物用灭菌水制成浓度适宜的均匀菌悬液或孢子悬液，取适量（一般为0.5m1）悬液滴加在灭菌沙土中，用接种针拌匀。

也可直接从斜面中取出孢子，接人沙土管中。

③干燥保藏：

将含菌的沙土管置干燥器中，真空干燥脱水（脱水干燥的时间在10h以内）或在干燥器内加P205或无水氯化钙干燥剂脱水干燥，然后将管口熔封。

置4℃冰箱保存。

若不熔封必须用石蜡封住管口或将棉塞替换成橡胶塞，再放在干燥器中保藏，注意经常更换干燥剂。

（2）适用范围：

本法特别适用于保藏有芽孢的细菌，产孢子的霉菌和放线菌，保藏期可达1～10年。

不适用于保藏无芽孢的细菌、酵母菌和以菌丝发育为主的真菌的保藏。

本法简便，设备简单；

用1支斜面菌即可一次制备几十支沙土管，可供几年内使用。

4、麸皮保藏法

本法与民间的大曲保藏法类似，不同的是用来保藏纯种。

①将麸皮与水或营养液按1：

0.8、l：

l或1：

1.5的比例（视菌种而异）混合，搅拌均匀使呈疏松状。

将拌匀的麸皮分装于若干安瓿或小试管中，塞上棉塞经121℃灭菌30min，将灭菌的安瓿或小试管置30℃恒温箱中培养3天，观察有无杂菌生长。

②取待保藏菌种的新鲜培养物，移种在麸皮管中培养，待孢子长成后即成曲。

③将菌种管放在装有氯化钙的干燥器中，在室温下脱水数日，然后置于干燥器移至20℃以下室温储藏，也可将脱水的菌种管熔封后至4℃冰箱保藏。

此法只适用于保藏大量产生孢子的各种霉菌和某些放线菌。

如根霉、毛霉、曲霉、青霉等。

保藏时间可达一至数年。

实验证明，红霉菌保藏12年仍有活力。

5、滤纸保藏法

本法系将待保藏菌种的菌体细胞或孢子悬液，吸附在无菌滤纸上干燥保藏。

（1）方法步骤：

①将滤纸片剪成0.8×

4cm的小长条，装在安瓿管中，每管一条，塞好棉塞，经121℃灭菌30min备用。

②将待保藏的菌种的新鲜斜面培养物，用脱脂牛奶、麦芽汁或营养肉汤等制成菌悬液。

用灭菌毛细吸管将菌液滴加在安瓿的纸条上。

③将安瓿置干燥器中，藏入P205作为干燥剂，抽气减压，干燥后保藏。

或将安瓿口熔封后于低温保藏，亦可置于干燥器皿内于4℃保藏。

④复活培养时，按无菌操作取出滤纸条，放在适宜的培养基中培养即可。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14～17年之久。

此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

据Goldiesmith1956年报道，芽枝霉科（Blastocladiaceae）菌种用此法保藏，取得很好的效果。

37株树状异水霉（Allomycesarbuscula）除2株之外，保藏期长达14年，其中有些菌株可达17年。

以上介绍的菌种保藏方法，均属于短期菌种保藏法。

上述菌种保藏方法3、4、5均属于干燥保藏法，只不过采用了不同的载体。

多数菌株在蒸馏水中不宜存活，但是许多真菌、假单菌属和某些需氧的放线菌的菌种在室温条件下即可存活数年。

用-20℃的冰箱保存菌种，可以适当延长菌种的保存时间，但是在使用过程中应当注意菌株是否产生变异，以及存活率是否符合要求。

低温冰箱保存菌种要留意冰箱温度的变化，要有应对停电事故的措施，融化后的菌种多不能再用低温保存，要重新移种后再冷藏。

因为反复冻融可以导致细菌死亡。

低温保藏菌种应当选择具有保护作用的介质（含10％甘油的磷酸盐缓冲液等）制备菌液。

6、液氮超低温保藏法

微生物在4～5℃条件下，代谢活动显著减弱，因此冰箱可用于保藏菌种，但时间不宜太长。

当温度达到-70℃时，菌体的原生质会形成稳定的“玻璃态”，能长时间保藏菌种。

故菌株在液氮（-196℃）、干冰或超低温冰箱中保藏，此时菌种的新陈代谢活动已停止，但不会死亡。

①选用玻璃管或者塑料管，做上标记，加棉塞灭菌，烘干或湿热灭菌后备用。

②由于本法菌种要经受超低温的冷冻过程，所以需要保护剂。

常用的保护剂10％的甘油蒸馏水溶液，用无菌的保护剂制备好菌液后，分装于灭菌安瓿中，每管装量为0.2～1ml。

③液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温，这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。

可以采用先将菌液降至0℃，再以快速降低温度（1℃／min）的方式一直降到-35℃，再将安瓿管放入由液氮维持的低温容器（气相）保藏。

本法是适用范围最广的微生物保藏法，保存期最长可达数十年以上，用其他法保藏不理想的菌种，可以用液氮保藏法。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌（尤其是用于一些不产孢子的菌丝体保藏）、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。

缺点是需要特殊设备。

本法是适用范围最广的微生物保藏法，保存期最长可达数十年以上，且性状不易变异，用其他法保藏不理想的菌种，可以用液氮保藏法。

本法是近些年才发展起来的，国外已经普遍采用。

7、冷冻真空干燥保藏法

（1）原理：

主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因速冻可使冰晶细致，不致损伤活菌细胞。

然后用真空抽气减压，使安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。

常用的冷冻剂：

CO2干冰加丙酮可达-70℃，液氮可达-150℃～-196℃，以氟利昂做制冷剂，用机械冷冻也可达-30～-80℃；

之间，冷冻l～2h即可。

常用的真空度多在2．67～4．00Pa左右。

（4）适用范围：

本法广泛适用于各类微生物的保藏，包括病毒和噬菌体。

其保存期可达一至数年之久，最长可达20年以上，是最有效的多数菌种的长期保藏方法。

（5）特点：

此法兼备低温、真空、干燥保藏条件，保藏效果非常好，储存期长、存活率高、变异率低，是目前广泛采用的好方法。

但本法操作较繁琐，需要一定的设备。

药品微生物检验用的菌种，包括控制菌检查的阳性对照菌株、抗菌试验用菌株等都是经常使用的菌种。

若要达到经常使用又能避免因传代次数过多引起的变异，单一的保藏方法是无法满足这个要求的。

所以保藏菌种时，一般从两方面进行。

一方面是选择保藏期长的保藏法，以保证菌种存活及降低变异率。

一般实验室可采用橡胶塞半固体琼脂管或液体石蜡法保藏。

若有条件尽量采用液氮低温保藏法或冷冻干燥保藏，特别是一些特殊菌种如破伤风梭菌、流感嗜血杆菌、乙型溶血性链球菌等。

另一方面是从长期保藏的菌种管中接种数支斜面或肉汤，供经常使用，此时可用简单易于操作的保藏方法，保藏期也不要太长，如冰箱保藏。

每支斜面或肉汤菌种使用几次即废弃，传代次数不能太多，以防止污染和变异。

英国药典2003版的无菌试验规定所用的菌株传代次数不超过5代。

数支菌种使用完后，从长期保藏的菌种重新转接数支置冰箱备用。

在转接过程中，若发现菌株某些特征改变，需重新分离、纯化或更换新的菌种。

第三节菌种检查与复壮

经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因易发生衰退、变异或死亡。

变异是生物的基本特性之一，当菌种处在新陈代谢水平最低的生活环境之中，生长繁殖受到外界抑制变为停滞状态，往往更容易发生变异。

因此各类菌种在保藏期间必须定期检查。

采取措施防止衰退、变异或死亡，发现变异或衰退时应及时给与恢复。

一、定期检查

定期检查是保藏菌种最基本的内容之一。

通过定期检查可以考察菌种的存活情况、形态特征、生理生化特性是否有异常以及保藏菌种的技术效果等。

定期检查的内容，除检查保藏菌种管的外观及干燥状态、真空度等一般项目之外，还须将菌种管启开培养复活。

干燥菌种管按前述的方法启开后，加入定量稀释剂或液体培养基将冻干菌种溶解，然后进行复活并检查菌种的存活率；

液体石蜡法或橡胶塞半固体法保存的菌种直接转种复活。

复活培养一般用液体培养基，这样容易形成单个菌体，使分离纯化时能形成单个纯菌菌落。

至少用复活培养两次即第三代培养物进行鉴定，菌种检定项目一般包括菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态（包括菌形、芽孢、鞭毛、荚膜等）、生化特性及血清学反应，并与保藏菌种的原始鉴定项目进行对照比较，具体鉴定内容可以参照《伯杰氏系统细菌学手册》，看是否存在污染或者出现了菌种的变异。

定期检查的间隔日期可视保藏菌种的类别、特性、保藏分方法及其它客观条件不同而定。

同样，药品微生物检验用菌种在一定间隔时间内也需要重新复活、分离、纯化、鉴定，再加以保藏。

如无条件鉴定，则应购买冻干菌种。

二、菌种的衰退

1、菌种衰退现象和原理

菌种经过长期人工传代培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象，称为菌种衰退。

具体表现为：

（1）原有形态性能改变及表现为不典型性状。

（2）生长速度变慢。

（3）代谢产物生产能力下降，即出现负变，这种情况极其普遍。

（4）致病菌对宿主侵染力的下降或者增强。

（5）对外界不良环境条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力下降等。

微生物容易发生遗传变异，在自然条件下，自然选择使那些对生存有利的变异菌株被保留下来，保证了微生物的进化。

因此，如果不加以控制，则大量的菌株自发突变，无用的菌株就可能泛滥，最后导致菌种的衰退。

菌种衰退的主要原因是基因的负突变，菌种的任何优良性状变异得不如原菌种，都是衰退的表现。

菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐渐演化过程。

首先在细胞群体中出现个别发生突变的菌株，这时如不及时发现并采取有效的措施，而一味的传代，则群体中的这种负突变个体的比例逐渐增大，最后占据了优势，整个群体发生严重的退化。

根据菌种衰退原理分析，可以制定出一些防止衰退的措施。

2、菌种衰退的防止

（1）控制传代次数：

很多微生物在复制和繁殖过程中，一方面经常发生自发性突变，繁殖越频繁，复制的次数越多，基因发生突变的概率也越高；

另一方面，突变的结果就越加强表现。

菌种应尽量避免不必要的接种和传代，以降低突变几率，特别是易变菌种，各代均须保藏原种，减少突变机会。

利用良好的保藏方法就可大大减少移种传代次数。

（2）创造适宜的培养条件：

培养条件对菌种的衰退有一定影响，因此提供适合原菌种生长繁殖的各种条件，是防止菌种衰退或变异的有效措施。

例如培养栖土曲霉时，若将培养温度从28～30℃提高到33～34℃，可防止产生孢子能力的衰退。

（3）用不同类型的细胞进行传代：

在放线菌与丝状真菌中，由于它们的菌丝细胞常为多核细胞，有的甚至是异核体，因此用菌丝体接种传代就容易出现衰退和不纯的子代，而孢子一般是单核，因此用孢子接种传代比菌丝体稳定。

例如用灭菌棉花球轻轻沾取放线菌的孢子后，再将其接种在斜面培养基上，即可避免接入菌丝，有防止菌种衰退作用；

但也有例外，如构巢曲霉用无性繁殖的分生孢子接种传代，比用有性生殖的子囊孢子接种传代更容易退化。

（4）采用有效的保藏方法：

不同的菌种由于菌种本身的特性的不同，采用的保藏方法也不尽相同，这样才能最有效的保存好菌种。

三、菌种的复壮

使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为复壮。

复壮包含两方面的内容：

一是指将衰退的菌种通过分离和生物学特性的测定，找出尚未衰退的个体；

二是指菌种自发突变但尚未衰退前，有目的地进行菌种的分离和测定，以期找出比原有菌种性能更优良的菌株。

通过各种方法复壮的菌种，必须经过形态特征、生理生化特性、代谢产物、血清学等一系列试验鉴定，证明复壮前后与原种完全一致者，方可认为菌种已被复壮；

否则得到的新菌株，只能是变异型菌株，此点应高度重视。

常用的菌种复壮方法：

（1）分离纯化：

保藏的菌种通过分离培养的方法，从表现退化的种群中可以分离选择保持原有典型性状单细胞或菌丝段，再经扩大培养即可恢复原菌种的特有形状。

常用的分离纯化方法很多，按纯度可归纳成两类：

一类是琼脂平板分离，达到了菌落纯水平；

另一类是单细胞（菌体或孢子）的分离法，如用显微镜操作选取单个菌或者孢子进行分离培养，则可达到细胞纯水平。

（2）通过宿主复壮：

很多寄生性微生物的退化菌种，将其接种到相应的昆虫或动植物宿主体内，传种数代常可恢复其原有的特性与毒力。

一些人类和动植物的寄生性传染病菌，毒力退化后常用此法复壮。

（3）淘汰退化：

在生物学中利用人工方法淘汰退化的生物个体，选育健壮的传代保种是常用的育种方法，即通过极端的逆境处理使那些抗性差的菌体死亡，留下未退化的健壮个体。

（4）理化因素诱变：

凡能利用物理或化学方法使之变异的微生