分子生物学.docx
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分子生物学
生物大分子 （biomacromolecule）:
具有较大的分子量,由简单的小分子排列组成,具有复杂的空间结构形成精确的相互作用系统,构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统.阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务.
基因芯片技术：
将大量探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于400）固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息.
基因:
是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位,对于编码蛋白质的结构基因来说，基因是决定一条多肽链的DNA片段。
根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类:
第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因.第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因.第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因.
基因组：
（genome）:
泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。
携带生物体全部遗传信息的核酸量。
基因组中不同的区域具有不同的功能：
有些区域编码蛋白质的结构基因
有些区域复制及转录的调控信号
有些区域的功能尚不清楚
真核生物基因组特点:
1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组.
2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。
一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链.
3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上
4.基因组中不编码的区域多于编码的区域
5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，splitgene）
6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小.
高度重复序列（highrepeatedsequence）
高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万（106）以上，因此复性速度很快
在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60％，在人基因组中约占20％。
高度重复顺序又按其结构特点分为三种：
反向重复序列、卫星DNA、较复杂的重复单位组成的重复顺序（灵长类动物独有）。
卫星DNA（satelliteDNA）：
由2-10bp组成重复单位，重复单位成串排列而成，由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA（或随体DNA），人的卫星DNA可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种。
microsatellitemarker又称shorttandemrepeat，（STR），最重要的优点是高度多态性，提供的信息量相对很大；另外可用PCR技术使操作实现自动化。
STR的遗传学图距是以cM（厘摩尔根）为单位的，反映基因遗传效应的基因组图。
中度重复序列（middlerepeatedsequence）:
Alu家族、KpnⅠ家族、Hinf家族、rRNA基因、多聚dＴ－dＧ家族、组蛋白基因。
多基因家族（multigenefamily）：
是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。
大致可分为两类：
一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，其可同时发挥作用，合成某些蛋白质（如：
组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内）。
另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质（如珠蛋白基因家族）
假基因（pseudogene）：
在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因，假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。
超基因（Supergene）：
人体基因组中还有几个大的基因簇，也属于中度重复序列的长分散片段。
在一个基因簇内含有几百个功能相关的基因，这些基因簇又称为超基因，如人类主要组织相容性抗原复合体HLA和免疫球蛋白重链及轻链基因都属于超基因。
可能是由于基因扩增后又经过功能和结构上的轻微改变而产生的，但仍保留了原始基因的结构及功能的完整性。
真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔序列（interveningsequences），称为内含子（intron），编码区则称为外显子（exon），内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA作为指导蛋白质合成的模板。
基因表达（geneexpression）：
DNA分子将其所承载的遗传信息，通过转录生成mRNA,再指导合成蛋白质的过程。
可诱导调节：
是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。
如乳糖操纵子。
可阻遏调节：
这类基因平时都是开启的，处在生产蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。
如色氨酸操纵子。
原核基因调控机制的类型与特点：
正转录调控（positive）：
调节基因的产物是激活蛋白（activator）
–正控诱导：
效应物使激活蛋白处于活性状态。
–正控阻遏：
效应物使激活蛋白处于非活性状态
负转录调控（negative）：
调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor）。
–负控诱导：
阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录。
–负控阻遏：
阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录。
转录正调控:
指调节产物（活化蛋白）结合结构基因上游的顺式作用元件,激活RNA聚合酶对转录的起始。
转录负调控:
指调节产物（阻遏蛋白）结合操纵基因,阻遏RNA聚合酶对转录的起始。
葡萄糖效应（降解物抑制作用）：
大肠杆菌生长在既有葡萄糖又有其他糖类（乳糖等）的介质中,只能利用葡萄糖,当葡萄糖耗尽后才能利用其他糖类,即葡萄糖阻断多种操纵子（葡萄糖敏感操纵子）的表达。
葡萄糖效应机理：
葡萄糖代谢降解物降低细胞内cAMP的浓度,不能与环腺苷酸受体蛋白CRP或称代谢降解物激活蛋白（CAP）形成足够的cAMP-CAP活性复合物以促使RNA聚合酶与启动子的结合,葡萄糖敏感操纵子不能表达.
乳糖操纵子包括：
•启动子（promotor,P）；
•操纵基因（operator,O）；
•结构基因（Z、Y、A）：
分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶、β-半乳糖苷乙酰基转移酶
乳糖操纵子调控模型的主要内容：
1ZYA基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；
2该mRNA分子的启动子（P）位于阻遏基因（I）与操纵基因（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；
3操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp）,是阻遏物的结合位点；
4当阻遏物与操纵基因相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制；
5诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因相结合，从而激发lacmRNA的合成。
trp操纵子的阻遏系统
trpR基因产物称为辅阻遏蛋白（aporepressor），与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵基因结合并关闭trpmRNA转录。
效应物是色氨酸，是由trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。
当培养基色氨酸含量高，它与辅阻遏蛋白结合，与操纵基因结合，阻遏mRNA的转录；当色氨酸不足时，辅阻遏蛋白失去色氨酸并从操纵基因上解离，trp操纵子去阻遏，mRNA开始转录。
trp操纵子的弱化系统：
1、弱化子：
位于trpE基因的起始密码前162bp的前导区中的123-150位碱基序列。
该区的mRNA可形成茎-环结构，有终止的作用。
2、前导肽：
在色氨酸操纵子的前导序列中可能存在前导肽，14个氨基酸。
在第10和11位上有相邻的两个色氨酸密码子。
前导区的序列分析：
具有4个分别以1、2、3、4表示的片段，能以两种不同的方式进行碱基配对：
1-2、3-4，或2-3配对。
3-4配对区正好位于终止密码子的识别区域。
形成发夹结构能力强弱：
序列1/2>序列2/3>序列3/4
3、转录弱化作用：
mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。
前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。
弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体的位置
4、细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。
二组分调控系统（two-componentsystems）：
由位于细胞质膜上的传感蛋白（sensorprotein）和位于细胞质内的应答调节蛋白（responseregulatorprotein）组成。
半乳糖操纵子（galactoseoperon）：
诱导物是半乳糖。
特点：
1.调节基因gelR与结构基因和操纵区距离很远；
2.两个启动子；
3.有两个O区。
葡萄糖升高，cAMP-CRP下降；葡萄糖下降，cAMP-CRP升高。
S1的转录：
无葡萄糖，有半乳糖，高浓度的CRP和cAMP。
抑制S2的转录。
S2的转录：
有葡萄糖。
一般认为：
cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1区复合物的形成开链构想，从而起始基因转录。
同时，由于S1和S2区的核苷酸部分重叠，这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制了S2起始的基因转录。
阿拉伯糖操纵子
•3个结构基因：
araB、araA、araD
•一个复合的启动子区、两个操纵区和一个调节基因araC。
•AraC蛋白同时具有正、负调节因子的功能。
•阿拉伯糖是诱导物。
AraC蛋白的正、负调节作用
•AraC蛋白本身是负调节蛋白-阻遏蛋白（Pr）；
•有阿拉伯糖、cAMP-CRP同时存在，AraC蛋白成为正调节蛋白-激活蛋白（Pi）
AraC蛋白的两种异构体：
Pr与Pi
细菌中的SOS应答与阻遏蛋白LexA
•SOS是细菌DNA受到破坏时，启动的诱导型DNA修复系统。
•LexA是SOS应答体系的阻遏蛋白。
•recA基因表达1000个RecA蛋白。
•DNA严重受损时，RecA蛋白与单链DNA缺口结合，被激活为蛋白酶，切割LexA蛋白使之失活。
多启动子调控的操纵子
•rRNA操纵子（rrnE）：
两个启动子P1和P2，P1是强启动子，快速生长时；P2营养缺乏时，弱启动子。
•核糖体蛋白SI操纵子（rpsA）：
四个启动子，P1P2强启动子；P3P4弱启动子。
•DnaQ蛋白操纵子：
DNA聚合酶亚基，校正DNA复制；受RNA聚合酶活性调节；
魔斑（magicspot）：
鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），可在层析谱上检出。
细菌缺乏氨基酸时，会大量合成这两种化合物。
影响RNA聚合酶与启动子结合。
作为警报素，产生应急反应。
抑制核糖体和其他大分子的合成，抑制与氨基酸转运无关的系统。
活化某些氨基酸操纵子的转录和表达，活化蛋白水解酶等。
转录后调控：
1.翻译起始的调控
2.稀有密码子对翻译的影响
3.重叠基因对翻译的影响
4.poly（A）对翻译的影响
5.翻译的阻遏
6.魔斑核苷酸水平对翻译的影响
基因簇（Genecluster）：
许多相关的基因按功能成套组合，同一家族成员有时紧密排列在一起，称为基因簇。
真核基因断裂结构的重要特点：
外显子-内含子连接区（exon-intronjunction）的高度保守性和特异性碱基序列。
GT-AG法则：
外显子-内含子连接区序列高度保守：
每个内含子5‘端起始的两个碱基都是GT,而3’端的最后两个碱基总是AG。
组成型剪切（constitutivesplicing）：
剪掉所有的内含子，将所有的外显子按顺序连接成一个完整的成熟mRNA。
选择性剪切（alternativesplicing）：
通过不同的剪接方式，产生不同的mRNA，并翻译成不同的蛋白质。
或转录时选择不同的启动子，或在转录产物上选择不同的poly（A）位点。
真核生物DNA水平上的基因表达调控：
通过基因组DNA的变化，包括基因丢失、扩增、重排和移位等方式，消除或变换某些基因并改变它们的活性，从而控制基因表达和生物活性的方式。
基因扩增：
某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。
基因重排：
一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录。
基因转换：
酵母的“交配型转换”现象，通过基因转换改变性别。
DNA甲基化与基因活性的调控：
•DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的活化和表达。
•能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变。
•引起某些遗传病。
完整基因的定义：
产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。
不但包括编码区，还包括5’和3’端长度不等的特异性序列。
真核基因的转录：
启动子：
决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件，在转录起始位点（+1）及其上游大约100-200bp内的一组具有独立功能的DNA序列。
1核心启动子（corepromoter）：
保证RNA聚合酶正常起始转录所必需的DNA序列，包括转录起始位点和上游的-25~-30bp处的TATA盒。
确定转录起始位点并产生基础水平的转录。
2上游启动子元件（upstreampromoterelement,UPE）：
包括-70bp附近的CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等，能通过TFIID复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
2、转录模板：
从转录起始位点到转录终止处的DNA序列。
终止位点：
3’端存在poly（A）位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。
可能存在共同的转录终止机制。
3.RNA聚合酶Ⅱ：
10-12个亚基组成。
羧基末端结构域（CTD）
4.RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子（TFⅡ）：
20种以上的蛋白因子，与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物。
5.终止位点：
3’端存在poly（A）位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。
可能存在共同的转录终止机制。
6.增强子：
指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
通常具有下列特性：
i.增强效应十分明显
ii.增强效应与其位置和取向无关。
iii.大多为重复序列:
（G）TGGA/TA/TA/T（G）。
iv.增强效应有严密的组织和细胞特异性。
v.要有启动子才能发挥作用,但没有基因专一性。
vi.受外部信号的调控。
7.沉默子（silencer）：
某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。
反式作用因子
•DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）。
•转录复合物分3部分：
–RNA聚合酶亚基。
–与转录起始或终止有关的辅助因子，不具基因特异性。
–与特异调控序列结合的转录因子。
•DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）。
1.反式作用因子中的DNA结合结构域
a.螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix,HTH）：
•至少有两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”。
一个α螺旋负责识别DNA的大沟，另一个与DNA主链骨架非特异性结合。
这类HTH蛋白以二聚体形式与DNA结合。
b.锌指（zincfinger）结构（图7-19）
•一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA结合。
•Cys2/Cys2锌指：
Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys
c.碱性-亮氨酸拉链结构（basic-leucinezipper,bZIP）（图7-20，-21）
•蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。
两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合形成拉链型二聚体。
•该二聚体的氨基端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。
d.碱性-螺旋-环-螺旋结构（basic-helix/loop/helix,bHLH）
•羧基端100-200aa形成两个α螺旋被非螺旋的环状结构所隔开；氨基端是碱性区。
该类蛋白形成同源或异源二聚体后，通过它们的碱性区与DNA相结合。
e.同源域蛋白（homeodomains）:
分子中含有约60个氨基酸的保守序列，这些序列参与形成了DNA的结合区。
C端有螺旋-转角-螺旋（HTH）样结构。
2.转录活化结构域:
具有转录调控功能的催化区域，常以复合物形式出现，依赖于DNA结合结构域以外的30-100个氨基酸残基完成蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
a.带负电荷的螺旋结构：
一种酸性的螺旋结构，有稳定转录起始复合物的作用。
如糖皮质激素受体AP1家族的Jun及GAL4
b.富含谷氨酰胺的结构：
如SP1、Oct1/2、Jun、AP2、血清应答因子（SRP）等。
c.富含脯氨酸的结构：
CTF-NF1、Oct1/2、Jun、AP2、SRP等。
真核基因转录调控的主要模式：
1、蛋白质磷酸化、信号传导及基因表达:
蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式。
细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导受体蛋白构象变化，使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内。
受体分子活化细胞功能的途径：
a.受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性。
b.配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或
c.酪氨酸激酶，从而传递信号。
d.受配体结合调控的离子通道
2、激素及其影响：
靶细胞具有专一的激素受体，可与激素形成复合物，导致结构或化学性质的变化，进入细胞核内，并与DNA的特定区域（激素应答元件，HRE）结合，起始或关闭基因的转录。
3、热激蛋白诱导的基因表达
•应答元件（responseelement）：
能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列。
•热休克蛋白（heatshockprotein）：
生物在最适温度范围以上，受热诱导合成的一系列蛋白。
分为Hsp90、Hso70、小分子Hsp及泛素4个家族。
•可能具有保护功能并在细胞正常生长和发育中起重要作用。
4、金属硫蛋白基因的多重调控
RNA的加工成熟
（1）rRNA的加工成熟
•分子内切割：
45S前体，核酸酶，成熟的18、28、5.8SrRNA。
•化学修饰：
碱基甲基化（原核），核糖甲基化（真核）。
•tRNA的加工成熟
•可能先生成前体tRNA，核苷修饰，生成4.5S前体tRNA,再剪接成4S成熟tRNA。
（2）mRNA的加工成熟：
先转录成核不均一RNA（hnRNA）
•5’’端加”帽子”；
•3’’端加上poly（A）；
•剪接；
•核苷酸的甲基化。
（3）真核基因转录后加工的多样性
•简单转录单位：
只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时则不需要加工。
1.无内含子，无poly（A），有一个保守的回文序列作为转录终止信号。
如组蛋白基因。
2.无内含子，需加poly（A），如腺病毒蛋白IX，α-干扰素和许多酵母蛋白。
3.有内含子，需剪接，需加poly（A），只产生一个有功能的mRNA。
如α和β-珠蛋白基因。
2.翻译水平的调控
涉及蛋白质合成的4种成分：
核糖体mRNA可溶性蛋白因子tRNA
▪Kozak提出的真核生物蛋白质合成的“扫描模式”：
40S核糖体亚基及有关合成起始因子首先与mRNA模板5’端处结合，然后向3’方向滑行，发现AUG起始密码子时，与60S大亚基结合形成80S起始复合物。
•mRNA5’端第一个AUG序列大部分都是A/GNNAUGG
•基因融合现象：
协调各种不同蛋白质生物合成。
可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控
（1）eIF-2磷酸化对翻译起始的影响：
eIF-2的α亚基磷酸化，与eIF-2B紧密结合，直接影响了eIF-2的再利用，从而影响了蛋白质合成起始复合物的生成。
（2）CBPII活性与翻译的起始：
帽子结合蛋白（CBP）：
能识别mRNA上的帽子，促使起始复合物形成。
基因的分子生物学定义：
DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。
还包括为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等所有的核酸序列（蛋白质基因和RNA基因）
细菌染色体基因组结构的特点
1.形成类核（nucleoid）：
由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体，并相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域。
类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋
2.染色体DNA通常与细胞膜相连：
连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。
在DNA链上，与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合
3.具有操纵子结构：
结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节，数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控
4.结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝，基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多,比病毒基因组多。
5.不出现基因重叠现象：
基因组中，编码顺序一般不会重叠。
6、具有相同的基因（isogene）:
编码同功酶（isoenzyme）
7.DNA分子中具有各种功能的识别区域：
这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序
8.具有终止子（termintor）：
基因或操纵子终末的特殊顺序，可使转录终止、RNA聚合酶从DNA链上脱落，终止子有强、弱之分。
强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，无需终止蛋白参与即可使转录终止。
弱终止子也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白（Rho因子）参与才能使转录终止。
9、结构基因中无内含子：
基因序列是连续的，因此在转录时不需要剪接加工，与真核生物不同。
病毒基因组的结构特点：
1.病毒基因组很小，且大小相差较大。
2.病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。
3.多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成。
4.基因重叠：
即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子
5.基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。
6.形成多顺反子结构（polycistronie）：
病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。
多顺反子可被一起转录成为含有多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA，然后再加工成各种蛋白质的模板mRNA。
7.除
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