国家自然基金项目申请书Word格式文档下载.docx

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募集后的β-catenin上的四个磷酸化位点先后被CK1和GSK3磷酸化，进而被泛素酶体识别并泛素化，从而进入由蛋白酶体主导的降解过程[5]。

当有Wnt（如Wnt3a）刺激时，细胞表面的Wnt受体Fizzle将在LRP5/6的协助下与Wnt蛋白结合，启动下游Dishevelled介导的CK1和GSK3对LRP6的磷酸化。

这一过程促使Axin由胞浆被募集到细胞膜内表面，从而缓解了Axin/APC复合体介导的β-catenin的磷酸化及最终的泛素化降解途径。

逃离了降解命运的β-catenin可以进入到细胞核内并与TCF/LEF相结合，并募集CBP/P300、Pygopus等转录辅激活子，激活下游调控基因如c-myc、cyclinD1、VEGF等的表达[6]。

在β-catenin的降解过程中，APC具有重要的作用。

研究表明，APC作为一个重要的抑癌基因，其突变将导致β-catenin不被磷酸化而稳定地存在于胞浆或细胞核内，持续激活其下游调控基因的表达，从而引起肿瘤的形成[6]。

另外，β-catenin基因自身的突变也能使其逃离被降解的命运，进而激活其下游调控基因的表达，引起肿瘤的形成。

现已知APC和β-catenin基因突变广泛存在于结直肠癌病例中[4]，因此，Wnt信号通路的异常激活对结直肠癌的发生发展具有重要作用。

关于动物模型的研究亦证明了前述观点：

例如APC基因突变的Min小鼠可自发产生结直肠癌；

氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）加右旋硫酸葡聚糖（Dextransulfatesodium,DSS）诱导的小鼠结肠炎相关性结直肠癌中常可检测到β-catenin的突变。

既然Wnt信号通路的异常激活对结直肠癌的发生发展起着重要的作用，任何影响Wnt信号通路的因素也都可能影响结直肠癌的发生发展。

β-catenin进入到细胞核内与TCF/LEF相结合后，需要募集多种转录辅激活因子才能激活靶基因的表达。

类固醇激素受体辅激活子（Steroidreceptorcoactivator,SRC）是一类包括SRC-1、SRC-2、SRC-3三个成员的具有重要功能的转录辅激活因子[7]。

Yang等报道SRC家族的SRC-2（GRIP1）对β-catenin的转录活性具有协同作用[8]，说明类固醇激素受体辅激活子家族成员能够参与调控Wnt信号通路。

Xie等报道SRC-3在35%的原发结直肠癌过表达，并且SRC-3的过表达与癌进程具有相关性：

在48％的晚期结直肠癌中存在SRC-3的过表达[9]，提示SRC-3可能是在结直肠癌的发生发展中起重要作用的转录辅激活因子。

SRC-3又称AIB1（Amplifiedinbreastcancer1），全长大约为160kD，由多个功能结构域组成：

N端的bHLH-PAS具有高度保守性，可与DNA结合或与其它具有相同结构域的蛋白结合；

中部结构域具有多个LXXLL序列，参与了与多种核受体（NuclearReceptor）的结合；

C端的转录活性结构域也具有多个LXXLL序列，参与了与辅激活子CBP/p300的结合。

SRC-3的C端还具有组蛋白乙酰转移酶（HAT）的活性，能与组蛋白甲基转移酶、精氨酸甲基转移酶（CARM-1、PRMT-1）相互作用，这说明SRC-3在核受体介导的染色质重组及启动子上转录复合体的组装等方面具有重要作用[7]。

最初的研究发现SRC-3在雌激素受体阳性的乳腺癌中过表达并在配体存在时与雌激素受体相互作用，促进其转录活性[10]。

在SRC-3敲除小鼠中癌基因H-ras或致癌剂诱导的乳腺癌以及大T抗原诱导的前列腺癌的发生和发展比对照小鼠明显变缓[12-13]，这表明SRC-3对乳腺癌和前列腺癌的发生和发展具有促进作用；

另外，乳腺特异性过表达SRC-3可诱发乳腺癌[14]，这表明SRC-3本身也是一个癌基因；

进一步的研究表明SRC-3可能是通过激活IGF/AKT信号转导通路来促进乳腺癌和前列腺癌的发生发展。

最近，我们在研究SRC-3在肝癌发生发展中的作用时发现SRC-3在68%的肝癌中过表达，并且SRC-3能促进肝癌细胞的增殖、侵袭、成瘤，揭示出SRC-3在肝癌发生发展中的重要作用[15]。

虽然SRC-3在多种癌的发生发展中起着重要作用，但SRC-3在结直肠癌的发生发展中是否起作用以及如何起作用目前仍不清楚。

我们的前期研究发现下调SRC-3的表达能够减缓结直肠癌细胞CT-26的增殖和集落形成（参见“研究基础”图1-3），进一步研究发现SRC-3能够增强β-catenin/TCF的转录活性（参见“研究基础”图4）。

根据这些研究结果，在本申请中我们提出这样的假说：

在结直肠癌中，过表达的SRC-3能够通过增强β-catenin/TCF的转录活性以促进其调控的下游基因表达，进而促进结直肠癌的发生发展。

为了验证这个假说，我们拟从如下几个方面进行研究：

首先通过基因沉默技术下调或用表达载体上调结直肠癌细胞中SRC-3的表达，研究SRC-3表达变化对结直肠癌癌细胞的增殖成瘤和侵袭转移等能力的影响以及SRC-3是否通过影响β-catenin/TCF的转录活性而影响其下游细胞生长相关基因的表达。

其次，为进一步在遗传学（动物水平）验证细胞水平的研究结果，我们还将利用SRC-3敲除小鼠进行AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌生成模型，以及SRC-3敲除小鼠和APC基因突变的Min小鼠的杂交后代小鼠体内结直肠癌生成模型，研究SRC-3基因缺失对结直肠癌的发生发展的影响。

最后，为了确定细胞和动物水平上研究的结果是否具有临床意义，我们将检测在结肠癌组织中SRC-3过表达与β-catenin/TCF调控的细胞生长和侵袭相关基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用和机制。

参考文献:

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4.Giles,R.H.etal.,CaughtupinaWntstorm:

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5.Rubinfeld,B.,etal.,BindingofGSK3betatotheAPC-beta-catenincomplexandregulationofcomplexassembly.Science,1996.272（5264）:

p.1023-1026.

6.MacDonaldB.T.,etal.,Wnt/beta-cateninsignaling:

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9-26.

7.Xu,J.,R.C.Wu,andB.W.O'

Malley,Normalandcancer-relatedfunctionsofthep160steroidreceptorco-activator（SRC）family.NatRevCancer,2009.9（9）:

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8．Yang,C.K.,etal.,Differentialuseoffunctionaldomainsbycoiled-coilcoactivatorinitssynergisticcoactivatorfunctionwithbeta-cateninorGRIP1.JBiolChem,2006.281（6）:

3389-3397.

9．Xie,D.etal.,CorrelationofAIB1overexpressionwithadvancedclinicalstageofhumancolorectalcarcinoma.HumPathol.2005,36（7）:

777-783

10.Anzick,S.L.,etal.,AIB1,asteroidreceptorcoactivatoramplifiedinbreastandovariancancer.Science,1997.277（5328）:

965-968.

11.Kuang,S.Q.,etal.,SRC-3/AIB1deficiencyaffectsinsulin-likegrowthfactorIsignalingpathwayandsuppressesv-Ha-ras-inducedbreastcancerinitiationandprogressioninmice.CancerRes,2004.64（5）:

1875-1885.

12.Chung,A.C.,etal.,Geneticablationoftheamplified-in-breastcancer1inhibitsspontaneousprostatecancerprogressioninmice.CancerRes,2007.67（12）:

5965-5975.

13.Kuang,S.Q.,etal.,Micelackingtheamplifiedinbreastcancer1/steroidreceptorcoactivator-3areresistanttochemicalcarcinogen-inducedmammarytumorigenesis.CancerRes,2005.65（17）:

7993-8002.

14.Torres-Arzayus,M.I.,etal.,HightumorincidenceandactivationofthePI3K/AKTpathwayintransgenicmicedefineAIB1asanoncogene.CancerCell,2004.6（3）:

263-274.

15.Xu,y.,etal.,OverexpressionofTranscriptionalCoactivatorAIB1PromotesHepatocellularCarcinomaProgressionbyEnhancingCellProliferationandInvasiveness.Oncogene,2010（inpress）.

2．

项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题

2.1研究内容

（1）SRC-3在结直肠癌细胞增殖成瘤和侵袭转移中的作用

SRC-3在结直肠癌细胞增殖、集落形成和成瘤中的作用

在前期研究工作中我们用TransIT-TKO转染试剂将小鼠SRC-3siRNA转染入小鼠结肠癌细胞CT-26中以下调SRC-3的表达，然后通过细胞增殖实验（MTT法）及细胞克隆形成实验发现下调SRC-3的表达能够减缓CT-26细胞的增殖和集落形成（参见“研究基础”图1-3），说明SRC-3表达变化会影响结直肠癌细胞的生长。

为了检测SRC-3表达变化是否会对多种结直肠癌细胞，特别是对人的结直肠癌细胞生长有影响，我们拟用人的SRC-3siRNA下调或用SRC-3表达载体上调人结直肠癌细胞HCT-116、HT29、SW480等中的SRC-3，然后通过细胞增殖实验及细胞克隆形成实验检测SRC-3表达变化对结直肠癌细胞生长的影响。

我们还将通过流式细胞技术检测细胞周期，检测下调SRC-3是否会导致细胞周期阻滞，以及上调SRC-3是否会促进细胞周期进程。

另外我们还拟通过检测cyclinD1、cyclinE、c-myc等与细胞生长相关基因的表达，了解SRC-3是否是通过影响这些基因的表达来影响结直肠癌细胞的生长。

SRC-3的表达变化对结直肠癌细胞生长和集落形成能力具有影响，那么SRC-3的表达变化是否会对结直肠癌细胞成瘤性和结直肠癌生长有影响？

为了回答这个问题，我们将进行结直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤实验，比较SRC-3下调的结直肠癌细胞和对照结直肠癌细胞的成瘤性及相应结直肠癌生长的差异。

SRC-3在结直肠癌细胞侵袭和转移中的作用

癌细胞的侵袭和转移在癌的发生发展中起着重要作用，而SRC-3具有促进前列腺癌和乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，因此我们推测SRC-3可能在结直肠癌细胞的侵袭和转移中具有重要作用。

为了验证这一点，我们将利用铺有Matrigel的Transwell来研究SRC-3下调或上调对结直肠癌细胞侵袭的影响。

细胞中基质金属蛋白酶（MMP）的表达变化会影响细胞的侵袭能力，因此我们将用酶谱法实验检测MMP-2、MMP-9、MMP-13的活性。

如在SRC-3下调的结直肠癌细胞中某种基质金属蛋白酶的活性下降，我们将用实时荧光定量PCR方法和Westernblot方法在转录水平和蛋白水平进行进一步的验证。

为了研究SRC-3对结直肠癌细胞在体内转移能力的影响，我们将利用小鼠结肠癌细胞CT-26肺转移模型进行研究：

将SRC-3下调的CT-26细胞和对照CT-26细胞通过尾静脉分别注射入BALB/c小鼠尾静脉中，2周后，检测SRC-3下调是否会降低CT-26细胞在肺部形成肿瘤的能力。

（2）SRC-3在结直肠癌中发生发展中作用的分子机理

作为一种重要的转录激活因子，SRC-3可以通过协同多种转录因子来促进结直肠癌的发生发展。

因为在结直肠癌的发生发展中Wnt信号通路的激活起了最重要的作用，本项目将重点研究SRC-3如何与Wnt信号通路中的β-catenin/TCF相互作用以促进结直肠癌的发生发展。

SRC-3对β-catenin/TCF转录活性的影响

在前期研究工作中我们将SRC-3、β-catenin、TCF4等表达载体分别或共同与β-catenin报告载体TopFlash用脂质体转染入CT-26细胞中，再检测β-catenin报告载体TopFlash的表达。

我们发现将SRC-3表达载体和β-catenin表达载体共同转染比将两种载体分别转染更能诱导β-catenin报告基因的表达，而将三者共转时比将二者共转又更加能诱导β-catenin报告基因的表达，这表明SRC-3能够增强β-catenin/TCF的转录活性（参见“研究基础”图4）。

我们还拟在结直肠癌细胞中以RNAi技术下调SRC-3的蛋白水平，而后将β-catenin、TCF4等表达载体分别或共同与β-catenin报告载体TopFlash转染入这些细胞中，再检测β-catenin报告基因的表达，来检验下调SRC-3能否减弱β-catenin/TCF激活靶基因表达的功能。

SRC-3与β-catenin/TCF的相互作用

既然SRC-3能够增强β-catenin/TCF的转录活性，我们推测SRC-3可能会与β-catenin/TCF直接相互作用。

为了验证这一点，我们拟将SRC-3、β-catenin、TCF4等表达载体共同转染入CT-26细胞中，而后通过免疫共沉淀（Co-IP）实验检测SRC-3是否能与β-catenin或TCF4相互作用。

如能，我们拟进行GST-pulldown实验检测SRC-3是否与β-catenin或TCF4在细胞外具有直接的相互作用。

我们还将构建表达SRC-3不同结构域的表达载体，通过GST-pulldown实验和免疫共沉淀实验进一步确定SRC-3与β-catenin或TCF4作用的结构域。

SRC-3对β-catenin/TCF的靶基因表达的影响

虽然通过细胞转染实验我们确定了SRC-3能够协同β-catenin/TCF促进β-catenin报告载体TopFlash的表达，但对于SRC-3能否协同β-catenin/TCF调控其靶基因如c-myc、cyclinD1、VEGF等的表达仍不清楚。

我们拟先通过实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测共同转染SRC-3、β-catenin、TCF4的结直肠癌细胞中的这些靶基因的表达水平是否增加，进而将表达水平有显著变增加的基因的启动子克隆到带有萤光酶（Luciferase）报告基因的质粒的上游后进行启动子转录活性分析，验证SRC-3能否协同β-catenin/TCF增强此靶基因的启动子活性。

（3）SRC-3缺失对结直肠癌发生发展的影响

SRC-3在AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌的发生发展中的作用

为了更好地在动物遗传学水平上研究SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用，我们还将利用AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌的模型，在SRC-3敲除的小鼠和正常对照小鼠体内诱导结肠炎相关性结肠癌，利用组织切片染色、免疫组化、荧光定量PCR和Westernblot等方法检测和分析SRC-3基因缺失对结肠癌的发生率、转移率、数目、大小、分期、增殖率、凋亡率等指标以及Wnt信号通路靶基因表达的影响。

SRC-3在APC突变引起的结直肠癌发生发展中的作用

我们还计划将SRC-3敲除小鼠与APC突变的Min小鼠进行杂交，从而筛选出SRC-3缺失而APC突变的杂交小鼠（APC纯合突变的小鼠会致死），进而研究此种杂交小鼠相对于单独APC突变的小鼠的结直肠癌产生、数目、大小、增殖情况以及Wnt信号通路靶基因表达的差异。

从而更好地在动物遗传学水平上验证SRC-3能否通过影响Wnt信号通路来影响结直肠癌的发生发展。

（4）在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性

为了检验细胞分子生物学和动物遗传学水平上的研究是否具有临床意义，我们拟用病理学确诊的结直肠癌组织为研究对象，其癌旁结肠组织为对照，通过实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测其中SRC-3的表达和Wnt信号通路靶基因的表达，分析SRC-3在结直肠癌中过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中作用的分子机制。

2.2研究目标

（1）确定SRC-3在结直肠癌细胞增殖成瘤和侵袭转移中的作用；

（2）确定SRC-3如何协同Wnt信号通路来促进结直肠癌发生发展；

（3）确定SRC-3缺失对AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌和APC突变引起的结直肠癌发生发展的作用；

（4）确定SRC-3在结直肠癌组织中的表达水平与肿瘤发生发展相关基因表达的关系，揭示SRC-3在结直肠癌发生发展中作用的分子机制。

2.3拟解决的关键问题

（1）SRC-3是否对结直肠癌的发生发展具有促进作用；

（2）SRC-3是否主要通过协同β-catenin/TCF来促进结直肠癌发生发展。

3拟采用的研究方案及可行性分析

3.1拟采用的研究方案

（1）总体研究思路和技术路线：

总体研究思路：

本课题中，我们将结合细胞分子生物学、动物遗传生理学和临床结直肠癌样品分析等研究手段进行研究。

首先通过基因沉默技术下调或用表达载体上调SRC-3在结直肠癌细胞中的表达，研究其对结直肠癌细胞的增殖成瘤和侵袭转移的影响以及探索SRC-3对于β-catenin/TCF的影响的分子机理；

接着在动物遗传学水平上研究体内SRC-3缺失对结直肠癌发生发展的影响；

最后检测在结直肠癌组织中SRC-3过表达与Wnt信号通路靶基因表达的相关性，揭示出SRC-3在结直肠癌发生发展中的作用及其机制。

技术路线：

（2）实验方法

（1）Westernblot测定蛋白表达水平：

按常规制备细胞裂解液，在SDS-PAGE胶上电泳，蛋白转膜后与相应抗体孵育，ECL试剂盒显示蛋白。

（2）萤光酶（Luciferase）活性测定：

将带有Luciferase报告基因的质粒转染入结直肠癌细胞中，24h后收集并裂解细胞。

然后将装有细胞裂解液的小管置于荧光光子测定仪中，并加入荧光素酶－荧光素反应液，即刻测定反应液加样品后10秒内释放的光子量，以此表示荧光酶活性。

（3）RNA干扰：

采用TransIT-TKO转染试剂（Mirus）将SRC-3siRNA转染入细胞中，三天后检测SRC-3的蛋白水平。

（4）实时荧光定量PCR测定基因转录水平：

提取细胞总RNA，以此为模板，oligodT为引物，反转录出cDNA。

根据特定基因用相应的引物和探针，以cDNA为模板在荧光PCR仪上进行PCR。

然后对实时PCR的曲线进行分析，通过比较其与标准品Ct值的差别，确定基因的转录水平。

（5）GSTPullDown实验：

将吸附在GS-4Bbeads上的与GST融合的体外翻译蛋白在Bindingbuffer中孵育，离心，将beads重悬于SDS-PAGE上样缓冲液，并进行SDS-PAGE电泳，电转，与体外翻译蛋白相应的一抗、二抗（HRP）孵育之后进行曝光显影。

（6）免疫共沉淀：

收集细胞，加入适量裂解液于冰上裂解细胞30min，离心，取上清液测定蛋白浓度。

加入proteinA/G吸附珠和相应抗体与细胞裂解液孵育4h，离心，倾去上清，沉淀部分用PBS洗三次，离心后吸净残留的PBS，加入40µ

L上样缓冲液悬浮，沸水浴5min，离心30s，上清用于电泳。

（7）细胞增殖实验（MTT法）：

将适宜浓度的100ul细胞悬液接入96孔板中。

细胞贴壁后，加入MTT。

37℃，5%CO2细胞培养箱孵育4小时后加入裂解液裂解过夜。