11人血浆中氯唑沙宗浓度的测定方法.docx
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11人血浆中氯唑沙宗浓度的测定方法
11．人血浆中氯唑沙宗浓度的测定方法
11.1仪器与色谱条件
11.1.1仪器TSQQuantumAccess三重四极杆串联质谱仪配备电喷雾离子源（ESI）源及Xcalibur2.0.7数据处理系统（美国ThermoScientific公司）；岛津LC-20AD液相泵,岛津CBM-20A系统控制器,岛津CTO-20A柱温箱，SIL-20AC自动进样器（日本岛津公司）；电子天平（型号BS124S，赛多利斯Sartorious公司）；旋涡混合器（型号XW-80C，上海医大仪器厂）；高速离心机（型号1612-1，上海手术器械厂）；数控超声清洗器（型号KQ2200DE，昆山市超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（型号HH-2，国华电器有限公司）。
11.1.2质谱条件用LC-MS/MS进行测定，离子源为ESI源，负离子化方式检测，喷雾电压为2.8kV；加热毛细管温度为350℃；鞘气（N2）压力为40Arb；辅助气（N2）压力为15Arb；碰撞气（Ar）压力为1.5mTorr；碰撞诱导解离（CID）电压分别为21eV（氯唑沙宗），23eV（瑞格列奈）。
扫描方式为选择性反应监测（SRM）用于定量分析的离子反应分别为m/z168.0→m/z132.1（氯唑沙宗）和m/z451.3→m/z379.3（内标瑞格列奈）。
11.1.3色谱条件色谱柱：
SHIMADZUShim-pack:
VP-ODS；5µ,Column size:
150×2.0mm；Serial NO.9042015；柱温：
40℃；流动相A为甲醇，流动相B为水相（含5mmol/L醋酸铵）；梯度洗脱，梯度设定为：
0～0.5min，B50%；0.5～1.0min，B10%；1.0～4.0min，B10%；4.0～4.5min，B50%；4.5～6.0min，B50%；流速：
0.3mL·min-1；进样量：
5µL。
11.2药品与试剂
11.2.1对照品内标瑞格列奈对照品为Dr.Reddy’sLaboratoriesItd公司产品，批号：
REWS0801；氯唑沙宗由中国药品生物制品检定所提供，批号：
100364-200301
11.2.2试验试剂甲醇、乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；醋酸铵为分析纯（南京化学试剂一厂）。
11.3方法学确证
11.3.1样品处理与测定
取人血浆样品200µL至Effendorf管，加入内标瑞格列奈（10µg/ml）50µL，混匀后加入乙腈600µL，涡旋振荡1min，12000转/min离心10min，取上清液10µL，加入990µL甲醇进行稀释，涡旋振荡30s混匀，取上清液5µL进样，测定受试者血浆中氯唑沙宗的浓度。
11.3.2专属性试验
在本试验条件下，氯唑沙宗的保留时间约为3.6min，瑞格列奈的保留时间约为4.0min。
通过对来自6个不同个体的空白血浆测定表明，血浆中的内源性杂质不干扰样品测定，受试者的空白血浆、空白血浆添加氯唑沙宗和内标（瑞格列奈）标准品及受试者服用受试制剂后的血浆样品的色谱图见图1-1至图1-3。
图1-1空白血浆样品测试的LC-MS/MS图
（上图为检测氯唑沙宗的色谱质谱图；下图为检测内标瑞格列奈的色谱质谱图）
图1-2空白血浆加氯唑沙宗（1µg/ml）和瑞格列奈LC-MS/MS测定试验图谱
（图谱来源于日内精密度研究中标准曲线第三个点的样品测试结果）
（tR氯唑沙宗=3.61min；tR内标=4.01min,C氯唑沙宗=1.02µg/ml）
图1-3受试者（No.R，第一周期，服用参比制剂，采血时间点：
2.5h）血浆样品测定图谱
（tR氯唑沙宗=3.61min；tR内标=4.01min,C氯唑沙宗=5.40µg/ml）
11.3.3标准曲线的建立
取Effendorf管8个，分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50µL，置40℃恒温水浴挥干。
分别加入健康人空白血浆200µL，使氯唑沙宗浓度分别为0，0.2，0.5，1，2，5，10，20µg/ml。
按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，以样品和内标峰面积比As/Ais为纵坐标，浓度Con.（µg/ml）为横坐标，以1/c2为权重系数进行回归，得血浆中氯唑沙宗标准曲线（见图2），结果氯唑沙宗在0.2-20µg/ml范围内线性良好。
回归方程为：
Y=0.0271923+0.346425*X，R2=0.9951，其中Y为样品和内标峰面积比（As/Ais），X为氯唑沙宗浓度。
预期可满足本研究中氯唑沙宗在人体内生物等效性研究。
图2人血浆中氯唑沙宗测定的标准曲线
11.3.4定量下限试验
在Effendorf管中分别加入氯唑沙宗标准品溶液各50µL，置40℃恒温水浴挥干。
分别加入健康人空白血浆200µL，使氯唑沙宗的浓度为0.2µg/ml。
按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20时的药物浓度作为本测定方法的定量下限，经测定本方法的氯唑沙宗的定量下限为0.2µg/ml（见图3）。
结果见表2。
图3定量下限（LLOQ）样品测定图谱
（上图为检测氯唑沙宗的色谱质谱图；下图为检测内标瑞格列奈的色谱质谱图）
表2定量下限试验结果（n=5）
加入浓度
（µg/ml）
测定浓度（µg/ml）
Mean
SD
RSD（%）
1
2
3
4
5
0.2
0.21
0.23
0.20
0.21
0.22
0.215
0.014
6.44
11.3.5精密度试验
在Effendorf管中分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50µL，于40℃恒温水浴挥干后，分别加入健康人空白血浆200µL，使氯唑沙宗浓度分别为0.5，5，16µg/ml。
按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，测定批内变异和批间（连续考察三天）变异。
结果表明，批内和批间变异均在15%以内，符合生物样品分析要求，见表3、4。
表3人血浆氯唑沙宗测定方法的批内精密度试验（n=5）
加入浓度
（µg/ml）
测定浓度（µg/ml）
Mean
SD
RSD（%）
1
2
3
4
5
0.5
0.50
0.49
0.50
0.48
0.47
0.487
0.015
3.13
5
5.11
4.96
4.95
4.78
4.99
4.958
0.119
2.40
16
15.57
15.48
15.25
15.75
15.06
15.422
0.272
1.76
表4人血浆氯唑沙宗测定方法的批间精密度试验（n=15）
加入浓度
（µg/ml）
批间精密度
测定时间
测定浓度（µg/ml）
Mean
SD
RSD（%）
1
2
3
4
5
0.5
第1天
第2天
第3天
0.50
0.49
0.50
0.48
0.47
第2天
第2天
0.47
0.49
0.40
0.46
0.45
0.483
0.031
6.34
第3天
第2天
0.49
0.52
0.51
0.51
0.51
5
第1天
第2天
第3天
5.11
4.96
4.95
4.78
4.99
第2天
第2天
5.03
5.22
5.35
5.24
5.37
5.082
0.196
3.87
第3天
第2天
4.96
4.90
5.00
4.93
5.44
16
第1天
第2天
第3天
15.57
15.48
15.25
15.75
15.06
第2天
第2天
15.95
16.22
16.31
15.98
18.16
16.002
0.757
4.73
第3天
第2天
16.49
15.28
16.59
16.23
15.71
11.3.6准确度试验
在Effendorf管中分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50µL，于40℃恒温水浴挥干后，分别加入健康人空白血浆200µL，使氯唑沙宗浓度分别为0.5，5，16µg/ml。
按“11.3.1样品处理与测定”项下操作,测定结果代入血浆标准曲线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得血浆中氯唑沙宗的相对回收率。
结果表明，各浓度的相对回收率均符合生物样品分析要求，见表5。
表5人血浆氯唑沙宗测定方法的准确度试验（n=5）
加入浓度
（µg/ml）
相对回收率（%）
Mean（%）
SD（%）
RSD（%）
1
2
3
4
5
0.5
100.25
97.19
100.69
95.33
93.66
97.42
3.05
3.13
5
102.18
99.24
99.09
95.54
99.74
99.16
2.38
2.40
16
97.32
96.72
95.29
98.46
94.14
96.39
1.70
1.76
11.3.7绝对回收率试验
在Effendorf管中分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50µL，于40℃恒温水浴挥干，分别加入健康人空白血浆200µL，使氯唑沙宗浓度分别为0.5，5，16µg/ml。
按“11.3.1样品处理与测定”项下操作,测定结果的峰面积与相同浓度标准品溶液直接进样的峰面积相比，算得血浆中氯唑沙宗的绝对回收率。
结果表明，各浓度的绝对回收率均为90%以上，见表6。
表6人血浆氯唑沙宗测定方法的绝对回收率试验（n=5）
加入浓度
（µg/ml）
绝对回收率（%）
Mean（%）
SD（%）
RSD（%）
1
2
3
4
5
0.5
95.46
96.72
99.59
92.99
93.61
95.67
2.64
2.76
5
98.46
94.01
96.10
95.25
92.65
95.30
2.20
2.31
16
100.92
99.16
98.79
100.26
97.96
99.42
1.18
1.18
11.3.8样品的稳定性试验
在Effendorf管中分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50µL，于40℃恒温水浴挥干后，分别加入健康人空白血浆200µL，配成氯唑沙宗浓度分别为0.5，5，16µg/ml的样品。
分别进行室温稳定性试验（20℃分别放置0和4h）、处理后稳定性试验（4℃放置0和24h）、冷冻贮存稳定性试验（-65℃冷冻放置0和30天）和冻融稳定性试验（反复冻融处理3次），然后按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，将测定结果的峰面积比代入血浆标准曲线计算实测值，评估样品的室温、处理后、冷冻放置和反复冻融稳定性。
结果表明实测值与加入量基本一致，说明氯唑沙宗在各条件下放置稳定，见表7到表10。
表7人血浆样品氯唑沙宗室温稳定性试验结果（n=5）
放置时间
加入浓度
（µg/ml）
测定浓度（µg/ml）
Mean
SD
RSD（%）
1
2
3
4
5
室温放置0h
0.5
0.49
0.52
0.51
0.51
0.51
0.507
0.
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