大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺Word文档下载推荐.docx

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1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。

2．（记忆）DNA的溶解性特点：

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；

DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。

【思考1】据图5－1分析：

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？

在0.14mol/L时溶解度最小；

要使DNA溶解，需要使用什么浓度？

较高浓度，可使DNA溶解；

要使DNA析出，又需要使用什么浓度？

0.14mol/L可使DNA析出。

【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。

3．（记忆）DNA的耐受性特点：

蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；

在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA分子不变性。

洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

4．（记忆）DNA的鉴定原理

当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。

在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。

、实验设计

【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）实验材料的选取：

选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。

2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：

鸡血：

向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。

洋葱：

向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。

【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。

3．（学会）去除滤液中的杂质：

方案一：

30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA－NaCl溶解液

方案二：

30mL滤液→加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10分钟→得DNA滤液

方案三：

30mL滤液→60～67℃处理→过滤得DNA滤液

思考5】以上三个方案的原理分别是什么？

方案一原理：

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；

方案二原理：

蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；

方案三原理：

DNA耐高温而蛋白质不耐高温。

【思考6】方案一中：

“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质；

“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质。

4．（记忆）DNA的析出：

DNA滤液与等体积冷却酒精混合，静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。

5．（记忆）DNA的鉴定：

取2支洁净的试管，编号甲、乙，各加入等量的

2mol/LNaCl溶液。

甲中放

入少量白色丝状物，使之溶解。

在甲、乙试管中各加

4mL二苯胺，混合均匀。

沸

水浴5min，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色

、操作提示

注意事项：

1．在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；

鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞

悬液浓度

2．实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。

3．玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。

4．二苯胺试剂要现用现配。

5．为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。

【活动4】观看视频：

观看“DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术

方法。

课后学习〗

1．尝试从植物组织中提取DNA分子。

2．基础训练册：

将基础知识整理到作业本上；

完成该节训练题。

〖学习要求〗

尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；

理解PCR技术的原理；

讨论PCR技术的应用

活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似

思考1】填写下表：

（记忆）细胞内DNA复制条件分析

条件

参与的组分

在DNA分子复制中的作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

打开DNA双螺旋

RNA聚合酶

合成RNA引物

DNA聚合酶

催化合成DNA子链；

切除引物

DNA连接酶

将不连续的DNA子链连接起来

能量

ATP

为解螺旋和合成子链提供能量

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3'

端起点

2．（理解）细胞内DNA的复制

1）DNA的结构：

脱氧核苷酸分子通过3,5－磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，

两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。

2）DNA的复制：

首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形成两条DNA单链。

其次，在DNA单链的3'

端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA引物。

再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'

端开始合成DNA子链。

最后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将

不连续的DNA子链连接起来

3．（记忆）DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：

在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：

在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：

缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。

控制仪器：

PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分？

核液。

【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）填写PCR反应流程：

2．（理解）PCR反应过程是：

在升温至90℃以上时DNA解旋；

在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合；

在升温至72℃左右时合成DNA子链。

二、实验操作

活动3】阅读教材P62“实验操作”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）在PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。

2．（了解）实验操作步骤：

按照PCR反应体系配方配制反应液；

将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

将微量离心管放到PCR仪中；

设置PCR仪的工作参数；

DNA在PCR仪中大量扩增。

3．（了解）水浴法：

将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。

三、操作提示

【活动4】阅读教材P62“操作提示”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

2．（记忆）将缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．（记忆）每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。

4．（记忆）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

四、结果分析与评价

【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）反应液稀释：

取2?

LPCR反应液，添加98?

L蒸馏水。

2．（记忆）分光光度计调零：

将100?

L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为零。

3．（记忆）将100?

L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．（记忆）DNA含量计算：

DNA含量（?

g）＝50×

光吸收值×

稀释倍数。

观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频，学会相关技术方法。

〖课后学习〗

完成该节训练题