常用缓冲液配置Word格式文档下载.docx
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1.称量181.7gTris置于1L烧杯中。
3.用浓盐酸调节pH值至8.8。
4.将溶液定容至1L。
4)3M醋酸钠(pH5.2)组份浓度:
3M醋酸钠配制量:
100ml配制方法:
1.称量40.8gNaAc·
3H2O置于100-200ml烧杯中,加入月40ml的去离子水搅拌溶解2.加入冰醋酸调节pH值至5.23.加去离子水将溶液定容至100ml4高温高压灭菌后,室温保存。
5)PBSBuffer组份浓度:
137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4配制量:
1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
NaCl
8g
KCl
0.2g
Na2HPO4
1.42g
KH2PO4
0.27g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加浓盐酸将pH值调节至7.4,然后加入去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后,室温保存。
上述PBSBuffer中无二价阳离子,如需要,可在配方中补充1mMCaCl2和0.5mMMgCl2。
6)10M醋酸铵组份浓度:
10M醋酸铵
配制量:
100ml配制方法:
1.称量77.1g醋酸铵置于100~200ml烧杯中,加入约30ml的去离子水搅拌溶解。
2.加去离子水将溶液定容至100ml。
3.使用0.22mm滤膜过滤除菌。
4.密封瓶口于室温保存。
醋酸铵受热易分解,所以不能高温高压灭菌。
7)苯酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)配制方法:
1.说明:
从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇(25:
1)。
氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。
2.配制方法:
将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24:
1)混合均匀后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
8)10%(W/V)SDS组份浓度:
10%(W/V)SDS配制量:
1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中,加入约80ml的去离子水,68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节pH值至7.23.将溶液定容至100ml后,室温保存。
9)2NNaOH组份浓度:
2NNaOH配制量:
1.量取80ml去离子水置于100~200ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热,有可能使玻璃烧杯炸裂)。
2.称取8gNaOH小心地逐渐加入到烧杯中,边加边搅拌。
3.待NaOH完全溶解后,用去离子水将溶液体积定容至100ml。
4.将溶液转移至塑料容器中后,室温保存。
10)2.5NHCl组份浓度:
2.5NHCl配制量:
1.在78.4ml的去离子水中加入21.6ml的浓盐酸(11.6N),均匀混合。
2.室温保存。
11)5MNaCl组份浓度:
5MNaCl配制量:
1.称取292.2gNaCl置于1L烧杯中,加入约800ml的去离子水后搅拌溶解。
2.加去离子水将溶液定容至1L后,适量分成小份。
3.高温高压灭菌后,4℃保存。
11)20%(W/V)Glucose组份浓度:
20%(W/V)Glucose配制量:
1.称取20gGlucose置于100~200ml烧杯中,加入约80ml的去离子水后,搅拌溶解。
12)SolutionI(质粒提取用)组份浓度:
25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA,50mMGlucose配制量:
1MTris-HCl(PH8.0)
25ml
0.5MEDTA(PH8.0)
20%Glucose(1.11M)
45ml
dH2O
910ml
2.高温高压灭菌后,4℃保存。
3.使用前每50ml的SolutionI中加入2ml的RNaseA(20mg/ml)。
13)SolutionII(质粒提取用)组份浓度:
200mMNaOH,1%(W/V)SDS配制量:
500ml配制方法:
1.量取下列溶液,置于500ml烧杯中10%SDS50ml2NNaOH50ml2.加灭菌水定容至500ml,充分混匀3.室温保存,此溶液保存时间最好不要超过一个月注意:
SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌
14)SolutionIII(质粒提取用)组份浓度:
3MKOAc,5MCH3COOH配制量:
500ml配制方法:
1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中。
KOAc
147g
CH3COOH
57.5ml
2.加入300ml去离子水后搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.高温高压灭菌后,4℃保存。
15)0.5MEDTA(pH8.0)组份浓度:
0.5MEDTA配制量:
称取186.1gNa2EDTA·
2H2O,置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌。
3.用NaOH调节pH值至8.0(约20gNaOH)。
pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。
4.加去离子水将溶液定容至1L。
5.适量分成小份后,高温高压灭菌。
6.室温保存。
16)1MDTT
组份浓度:
1MDTT配制量:
20ml配制方法:
1.称取3.09gDTT,加入到50ml塑料离心管内。
2.加20ml的0.01MNaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22mm滤器过滤除菌。
3.适量分成小份后,-20℃保存。
17)10mMATP组份浓度:
10mMATP配制量:
1.称取121mgNa2ATP·
3H2O,加入到50ml塑料离心管内。
2.加20ml的25mMTris-HCl(pH8.0),搅拌溶解。
一.常用贮液与溶液
1mol/L亚精胺(Spermidine):
溶解2.55g亚精胺于足量的水中,使终体积为10ml。
分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L精胺(Spermine):
溶解3.48g精胺于足量的水中,使终体积为10ml。
10mol/L乙酸胺(ammoniumacetate):
将77.1g乙酸胺溶解于水中,加水定容至1L后,用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白(BSA):
加100mg的牛血清蛋白(组分V或分子生物学试剂级,无DNA酶)于9.5ml水中(为减少变性,须将蛋白加入水中,而不是将水加入蛋白),盖好盖后,轻轻摇动,直至牛血清蛋白完全溶解为止。
不要涡旋混合。
加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L二硫苏糖醇(DTT):
在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水,分成小份贮存于-20℃。
或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管,加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。
8mol/L乙酸钾(potassiumacetate):
溶解78.5g乙酸钾于足量的水中,加水定容到100ml。
1mol/L氯化钾(KCl):
溶解7.46g氯化钾于足量的水中,加水定容到100ml。
3mol/L乙酸钠(sodiumacetate):
溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中,用冰乙酸调溶液的pH至5.2,再加水定容到100ml。
0.5mol/LEDTA:
配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液(0.5mol/L),混合后形成EDTA的三钠盐。
或称取186.1g的Na2EDTA·
2H2O和20g的NaOH,并溶于水中,定容至1L。
1mol/LHEPES:
将23.8gHEPES溶于约90ml的水中,用NaOH调pH(6.8-8.2),然后用水定容至100ml。
1mol/LHCl:
加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。
25mg/mlIPGT:
溶解250mg的IPGT(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)于10ml水中,分成小份贮存于-20℃。
1mol/LMgCl2:
溶解20.3gMgCl2·
6H2O于足量的水中,定容到100ml。
100mmol/LPMSF:
溶解174mg的PMSF(苯甲基磺酰氟)于足量的异丙醇中,定容到10ml。
分成小份并用铝箔将装液管包裹或贮存于-20℃。
20mg/ml蛋白酶K(proteinaseK):
将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。
10mg/mlRnase(无DNase)(DNase-freeRNase):
溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中(pH5.0)。
溶解后于水浴中煮沸15min,使DNA酶失活。
用1mol/L的Tris-HCl调pH至7.5,于-20℃贮存。
(配制过程中要戴手套)
5mol/L氯化钠(NaCl):
溶解29.2g氯化钠于足量的水中,定容至100ml。
10N氢氧化钠(NaOH):
溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中(磁力搅拌器搅拌),氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。
10%SDS(十二烷基硫酸钠):
称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中,用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。
用水定容至1L。
2mol/L山梨(糖)醇(Sorbitol):
溶解36.4g山梨(糖)醇于足量水中使终体积为100ml。
100%三氯乙酸(TCA):
在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水,用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。
(稀释液应在临用前配制)
2.5%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷):
溶解25mg的X-gal于1ml的二甲基甲酰胺(DMF),用铝箔包裹装液管,贮存于-20℃。
100×
Denhardt试剂(Denhardt'
sregent)
成分及终浓度
配制100ml溶液各成分的用量
2%聚蔗糖(Ficoll,400型)2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)2%BSA(组分V)水
2g2g2g加水至总体积为100ml
依照上表称取各组分,溶于水中定容。
过滤除菌及杂质,分装成小份于-20℃贮存。
10×
标准DNA连接酶缓冲液(standardDNAligasebuffer)(粘端、平端连接)
配制10ml溶液各成分的用量
0.5mol/LTris-HCl100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT2mmol/LATP5mmol/L盐酸亚精胺(可选)0.5mg/mlBSA(组分V)(可选)水
5ml1mol/L贮液1ml1mol/L贮液1ml1mol/L贮液200ul100mmol/L贮液50ul1mmol/L贮液0.5ml10mg/mL贮液2.25ml
将配制好的缓冲液分装成小份,贮存于-20℃。
100mmol/LdNTP溶液(dNTPsolutions)可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液,-80℃可贮存至少6个月。
10mmol/LdNTP混合液
配制20ul溶液各成分的用量
10mmol/LdATP10mmol/LdCTP10mmol/LdGTP10mmol/LdTTP水
2ul100mmol/LdATP贮液2ul100mmol/LdCTP贮液2ul100mmol/LdGTP贮液2ul100mmol/LdTTP贮液12ul
20%PEG8000/2.5MNaCl
质量浓度为20%聚乙二醇2.5mol/L氯化钠水
20g50ml5mol/L氯化钠或14.6g固体氯化钠补足100ml
加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中,加水至终体积100ml,用磁力搅拌器搅拌溶解。
20×
SSC
配制1L溶液各成分的用量
300mmol/L柠檬酸三钠(二水)3mol/L氯化钠水
88.2g175.3g补足1L
溶解柠檬酸三钠(二水)和氯化钠于约0.9L水中,加几滴10NNaOH溶液调pH为7.0,用水补足体积至1L。
DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水加100ulDEPC于100ml水中,使DEPC的体积分数为0.1%。
在37℃温浴至少12h,然后在15psi条件下高压灭菌20min,以使残余的DEPC失活。
DEPC会与胺起反应,不可用DEPC处理Tris缓冲液。
甲酰胺(deionizedformamide)直接购买或加DowexXG8混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中,用磁力搅拌器轻轻搅拌1h,可去除甲酰胺中的离子。
经Whatman1号滤纸过滤除去树脂后分成小份,充氮气于-80℃贮存(防止氧化)。
磷酸缓冲液(phosphatebuffer)按照下表所给定的体积,混合1mol/L的磷酸二氢钠(单碱)和1mol/L磷酸氢二钠(双碱)贮液,获得所需pH的磷酸缓冲液。
配制1mol/L的磷酸二氢钠(NaH2PO4·
H2O)贮液:
溶解138g于足量水中,使终体积为1L;
1mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)贮液:
溶解142g于足量水中使终体积为1L。
1mol/L
磷酸二氢钠(ml)
磷酸氢二钠(ml)
最终pH值
877850815775735685625565510450390330280
123150185225265315375435490550610670720
6.06.16.26.36.46.56.66.76.86.97.07.17.2
TE(用于悬浮和贮存DNA)
成分及终浓度
配制100ml溶液各成分的用量
10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTA水
1ml1mol/LTris-HCl(pH7.4-8.0,25℃)200ul0.5mol/LEDTA(pH8.0)98.8ml
Tris缓冲液(Tris-HClbuffer)将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中,再根据所要求的pH(25℃下)加一定量的浓盐酸(11.6N),用水调整终体积至1L。
浓盐酸的体积(ml)
pH
8.6142128.53846566671.376
9.08.88.68.48.28.07.87.67.47.2
二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
电泳缓冲液
50×
Tris-乙酸(TAE)缓冲液
2mol/LTris碱1mol/L乙酸100mmol/LEDTA水
242g57.1ml的冰乙酸(17.4mol/L)200ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0)补足1L
5×
Tris-硼酸(TBE)缓冲液
445mmol/LTris碱445mmol/L硼酸盐10mmol/LEDTA水
54g27.5g硼酸20ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0)补足1L
染料
1%溴酚蓝(bromophenolblue)加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中,搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
1%二甲苯青FF(xylenecyanoleFF)溶解1g二甲苯青FF于足量水中,定容到100ml。
10mg/ml的溴化乙锭(ethidiumbromide)小心称取1g溴化乙锭,转移到广口瓶中,加100ml水,用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。
用铝箔包裹装液管,于4℃贮存。
凝胶上样液(gelloadingsolutions)6×
碱性凝胶上样液(室温贮存)
配制10ml溶液各成分用量
0.3N氢氧化钠6mmol/LEDTA18%聚蔗糖(400型)0.15%溴甲酚绿0.25%二甲苯青FF水
300ul10N氢氧化钠120ul0.5mol/LEDTA(pH8.0)1.8g15mg25mg补足到10ml
6×
聚蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
0.15%溴酚蓝0.15%二甲苯青FF5mmol/LEDTA15%聚蔗糖(400型)水
1.5ml1%溴酚蓝1.5ml1%二甲苯青FF100ul0.5mol/LEDTA(pH8.0)1.5g补足到10ml
溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖(400型)水
2.5ml1%溴酚蓝2.5ml1%二甲苯青FF1.5g补足到10ml
甘油凝胶上样液(4℃贮存)
0.15%溴酚蓝0.15%二甲苯青FF5mmol/LEDTA50%甘油水
1.5ml1%溴酚蓝1.5ml1%二甲苯青FF100ul0.5mol/LEDTA(pH8.0)3ml3.9ml
蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
0.15%溴酚蓝0.15%二甲苯青FF5mmol/LEDTA40%聚蔗糖水
1.5ml1%溴酚蓝1.5ml1%二甲苯青FF100ul0.5mol/LEDTA(pH8.0)4g补足到10ml
十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液(室温贮存)
0.2%溴酚蓝0.2%二甲苯青FF200mmol/LEDTA0.1%SDS50%甘油水
20mg20mg4ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ul10%SDS5ml补足到10ml
三.常用培养基
1)LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中:
蛋白胨
10g
酵母提取物
5g
氯化钠
如果需要用1NNaOH(~1ml)调整pH至7.0,再补足水至1L。
注:
琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
SOB培养基将下列组分溶解在0.9L水中:
20g
0.5g
1mol/L氯化钾
2.5ml
用水补足体积到1L。
分成100ml的小份,高压灭菌。
培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。
2)SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制,只是在培养基冷却到室温后,除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外,再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中,再用水补足到100ml,用0.22um的滤膜过滤除菌)。
3)TB培养基将下列组分溶解在0.9L水中:
12g
24g
甘油
4ml
各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60℃,再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中,使终体积为100ml。
高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌)。
4)2×
YT培养基将下列组分溶解在0.9L水中:
16g
5)YPD培养基将下列组分溶解在0.9L水中:
葡萄糖
用水补足体积为1L后,高压灭菌。
建议在高压灭菌之前,对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸,因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。
为了配制平板,需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。
四.常用抗生素
1)氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml)溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
2)羧苄青霉素(carbenicillin)(50mg/ml)溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中,最后定容至10ml。
3)甲氧西林(methicillin)(100mg/ml)溶解1g甲氧西林钠于足量的水中,最后定容至10ml。
常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
4)卡那霉素(kanamycin)(10mg/ml)溶解100mg卡那霉素于足量的水中,最后定容至10ml。
常以10ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生