液相色谱柱基质材料的发展Word格式文档下载.docx

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聚酰胺也称为锦纶或尼龙,其吸附机理主要来自聚酰胺内的酰胺键,可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键,例如,聚酰胺树脂可以吸附保健品中具有羟基、羧基或酚羟基的黄酮类化合物。

在离子交换色谱中,离子交换树脂主要是利用高分子化学的加聚反应。

一般首先合成高分子离子交换树脂的骨架,然后在骨架上添加功能基。

如果需要得到大孔树脂,则在聚合过程中加入致孔剂,如果不添加致孔剂,则得到凝胶型树脂。

在高分子离子交换树脂中,骨架多数采用交联度为1%～20%范围的聚苯乙烯,它由二乙烯苯交联制得,结构稳定,通过磺化反应可制备强酸性阳离子树脂;

通过氯甲基化后,再与各种胺反应,可得到各种阴离子树脂。

少数离子交换树脂的骨架可由交联聚丙烯酸类树脂构成。

在亲和色谱中,固定相由载体、键合臂和具有特殊选择性的亲和基团组成,该亲和基团称为配基。

常见的载体有琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺和硅胶等。

配基有两大类,第一类是具有专一亲和力,如抗原与其对应的抗体。

另一类是没有专一亲和力的假亲和色谱,这类配基典型的代表是染料配基和硼酸盐配基。

其中,免疫球蛋白IGG的检测过程中使用的蛋白柱即是一种亲和色谱柱,免疫球蛋白IGG与蛋白柱之间的亲和作用及洗脱过程是通过流动相中的pH值、离子强度及化学组成来控制的,该类亲和色谱柱易滋生霉菌,因此柱子的存储十分重要,比如蛋白柱就需要保存在20%的乙醇的水溶液中,并冷藏于4℃环境。

纵观几大分离色谱,大多数具有特异分离效果的色谱材料均是复合型色谱填料,以下重点介绍的是制备型及分析型液相色谱柱色谱填料的种类、整体柱及色谱基质的表征手段。

1基质填料种类

1.1硅胶

无机基质材料中最重要的是硅胶,微粒型硅胶的出现,促进了高效液相色谱法的发生与发展。

用作色谱填料基质的硅胶是通过人工合成的,其制备方法多样,大都拥有各自的专利。

合成色谱用硅胶区别于天然晶体二氧化硅,也区别于介于晶型和无定型之间的用于色谱、电色谱中的石英毛细管,用作色谱填料的是无定型二氧化硅。

硅胶吸附色谱是色谱中的经典,硅胶至今仍是制备色谱中填充柱的主要材料,250目～400目（即40μm～63μm直径）的硅胶颗粒的含水量直接影响活性,其活性随着含水量的升高而降低。

当其含水量接近20%的时候,硅胶基本不具吸附活性;

活性太高,则出现不可逆吸附和拖尾,甚至分离物分子结构的改变。

以下将重点介绍其化学修饰及聚合物包覆的过程。

硅胶能用于色谱基质材料,是因为其表面具有重要的活性基团硅羟基,即自由硅羟基,或称孤立硅羟基。

由于游离的硅羟基是造成色谱峰尤其是碱性溶质拖尾的主要原因,因此在合成反相色谱材料中,针对硅羟基的封尾技术非常重要。

例如C18柱,在键合了十八烷基后,还需通过小分子的硅烷化试剂（例如三甲基氯硅烷）对其进行封尾,以尽可能地减小极性大的硅羟基对整体呈现非极性的色谱柱的影响,如若硅羟基外露,封尾不完全,势必影响反相色谱的保留时间和色谱峰型。

对硅胶表面进行的改性是通过该活性基团进行的,通过各种硅烷化试剂对硅胶表面进行修饰,可以得到包括烷烃和芳烃在内的烷基反相填料。

常用的硅烷化试剂除了氯硅烷和烷氧基硅烷外,还有烷基硅氨烷。

例如:

在硅羟基上键合十八烷基,可制得液相色谱柱中常用的C18柱（ODS）;

以氨基、羧基、磺酸基修饰,可得到离子交换填料;

以聚乙二醇修饰,可得到疏水作用的填料。

对于化学键合相硅胶,在孔径、粒径相当的前提下,稳定性是其最重要的指标,稳定性主要指柱流失。

柱流失的程度取决于键合反应时的条件是否控制得当,即是否由于水的存在,而生成易溶于有机相中的副产物;

值得指出的是,在硅胶的预处理过程对最终硅胶基质填料的稳定性也有十分重要的影响,在预处理过程中,需要无机酸浸泡,以除去硅胶表面存在的会造成峰型拖尾,甚至不可逆吸附强极性杂质的Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等金属离子。

1.2氧化铝

用作吸附材料和色谱填料基质的氧化铝主要是γ-氧化铝,γ-氧化铝表面化学修饰比硅胶更困难,因此氧化铝多使用于一些小分子有机化合物的分离,用于正相、离子交换色谱和反向高效液相色谱中,在生化分离上应用得少。

氧化铝的化学修饰可通过铝羟基的反应或是涂覆技术。

通过铝羟基反应可通过在氧化铝表面上的活性羟基键合C4、C8和C18等烷基,制得在宽pH范围内稳定,应用于反相色谱中的烷基化氧化铝。

表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等强疏水性复合材料。

在吸附型制备色谱中,氧化铝的吸附能力比硅胶更强,氧化铝比硅胶的样品处理量更大,根据含水量大小（0%～15%）,大多情况下,需要控制的含水量为6%～10%,对应的活性为第三和第四等级。

根据酸碱性,应用于吸附色谱中的氧化铝分为中性、酸性和碱性氧化铝,中性氧化铝水提取液的pH值为7.5,适用于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定化合物,如酯、内酯等化合物的分离,因此应用十分广泛。

大多数情况下使用的是碱性氧化铝水提取液的pH值为9～10,常应用于碳氢化合物的分离,能中碳氢化合物中除去含氧化合物,还能对某些色素,甾族化合物、生物碱、醇以及其他中性、碱性物质的分离。

酸性氧化铝水提取液的pH值为4～4.5,适用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。

1.3氧化锆

氧化锆和硅胶一样，具有优异的机械强度，适宜的孔结构和可用于键合其他功能基团的活性位点外，还具有更宽的pH耐受范围和更好的耐温性。

氧化锆多孔小球可耐受pH0～14的环境，可高达900℃的温度下长时间工作不会变形且结构不遭受破坏。

碳十八键合二氧化锆（ODZ）可在pH2～12范围内使用。

聚丁二烯包覆二氧化锆复合填料在全pH值范围内稳定，并且能耐200℃的柱温。

王晖等制备强离子（HO3S-PS-ZrO2）和强阴离子新型固定相[（Me）3N+-PS-ZrO2]，并尝试性地用于糖、核苷、核苷酸和脱氧核苷酸的分离。

1.4复合型填料

复合型填料在上文中已有提及,一般而言,硅胶基质化学键合相在pH2～8的范围内稳定,难以耐受更宽的pH范围,在碱性条件下硅胶基质会发生溶解,于是人们将机械强度较低、在有机溶剂中易发生溶胀的高聚物引入到硅胶基质填料中,与硅胶形成优势互补,制备出有机-无机复合型填料,即包覆型填料或涂覆型填料。

硅胶、氧化铝、氧化锆等都曾被用作包覆型填料的基质材料,其中最重要的是硅胶和氧化锆。

用于包覆无机基质填料的高聚物则有聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚环氧乙烷、聚硅氧烷、琼脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及气相沉积碳等。

早期包覆型填料的制备采用物理包覆法,制得的复合物孔径结构不甚可控,重现性差。

后期采用的是化学键合或复合型包覆法。

该法首先利用无机基质表面修饰技术,使硅胶、氧化铝或氧化锆等基质的表面带上适合数量的活性基团,例如可发生加合反应的双键、环氧基团、氨基或羧基等,再将制备高聚物所需的单体、交联剂等涂覆到基质表面,然后通过加入引发剂,控温等条件引发化学键合或共聚反应,制得包覆层紧密牢固的复合色谱填料。

但是由于聚合物包覆不完全,裸露出来的无机基质会吸附路易斯碱性物质,特别会吸附蛋白质而导致峰型变差,这种吸附可以通过有机物热蒸汽化学气相沉积法使热解碳对裸露无机基质进行包覆。

在键合固定相中特别值得提及的是用于手性拆分药物、酸类、酰胺类化合物的手性分离固定相。

手性固定相所使用的高分子基球通常是粒径单分散的缩水甘油甲基丙烯酸-亚乙基二异丁烯酸酯共聚物微球、一锅法制备的单分散聚甲基丙烯酰胺球、聚硅氧烷、光学活性聚氨基甲酸乙酯以及聚苯乙烯。

通过共价键或涂覆方式,发展了Pirkle型（刷型）、多糖类、环糊精类、冠醚类、杯芳烃等多种类型的手性固定相。

Pirkle型手性固定相的起源是被称为CSA的手性溶解试剂;

多糖类手性固定相主要包括纤维素类和直链淀粉类;

环糊精（CDs）是含有以α-1,4-连接的β-吡喃葡萄糖单元的环状非还原寡糖。

目前,常见的环糊精有三种:

6个葡萄糖单元的α-CD,7个葡萄糖单元的β-CD和8个葡萄糖单元的γ-CD。

β-CD的空间结构似笼状,可以包结许多水溶性及非水溶性化合物,例如苯酚。

同时因为β-CD的大小适中,而且具有21个羟基活性位点,可键合烷基、羟烷基、氨基、巯基、糖基、麦芽糖基、甲基、羟乙基、羟丙基、乙酰基等修饰基团,灵活多变,可塑性强,是搭建手性分离的桥梁。

1.5整体柱

整体柱区别于微粒型填料填装,是由单体、交联剂、致孔剂以及引发剂在柱子内通过可控制的原位聚合反应形成连续、整体型的柱床。

整体色谱柱合并填料合成、筛选与装柱过程,得到均匀的色谱床层结构,稳定性和重现性更好。

具有利于传质的小孔（孔径小于2nm）和中孔（孔径2nm～50nm）,在较大流速下仍然具有较低的柱压,传质速度快,适合快速分析和梯度模式。

整体柱主要分为有机整体柱和无机整体柱,有机整体柱主要包括聚丙烯酰胺类整体柱、聚甲基丙烯酸酯类整体柱、聚苯乙烯类整体柱和分子印记整体柱。

近几年来,整体柱备受科研机构关注的原因是因为整体柱在合成过程中本身就可以通过选择单体、交联剂的种类来合成高密度的活性位点,例如:

在GMA-EDMA整体柱上,可引入环氧基团、双键等活性基团,通过对环氧基团进行修饰,可以键合环糊精等具有手性分离功能手性分离配基。

目前整体柱已经在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用,可用于分离脱氧核糖核酸、肽、蛋白质、氨基酸、低聚核苷酸、类固醇、芳烃、酚类等物质,具有广泛的应用前景。

马志玲等以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,环己醇和正十二醇混合溶液为致孔剂,偶氮二异丁腈为引发剂,制备了毛细管整体柱基质,使用Epoxy方法在基质表面键合牛血清白蛋白（BSA）,制得BSA修饰的毛细管整体柱,将此毛细管整体柱应用于毛细管电色谱中,成功地分离出了组氨酸对映体。

但该类蛋白质手性分离色谱柱存在保存困难,使用寿命短的缺点。

可能因为整体柱的制备及键合反应过程尚未能精确受控,净化过程耗时长,及使用过程中可能出现脱模,及应用上与同类型商品化柱子相比较的优势,距离规模商品化还有待深入探索。

2基质填料的性能表征

对于应用于色谱柱中的基质填料,必须通过一系列的表征手段来考察其性能。

对于液相色谱而言,色谱柱最重要的参数主要有粒径及粒径分布、孔径及孔径分布、比表面积以及比孔容、表面形貌、柱效、渗透性及柱压耐受性等物理及表面性质。

而化学性质则主要包括基质填料功能基团的结构解析及键合量。

2.1物理及表面性质的表征

填料的表面形貌、粒径形状大小及粒径分布主要通过高倍数的扫描电镜进行观测,扫描电镜图是优化填料合成条件强大的直观评价依据;

孔径分布和比表面积一般可通过氮吸附法测定,了解基质材料在微孔、中孔及大孔范围内的孔径分布。

2.2化学性质的表征

对于大多数液相色谱填料的功能基团,在中红外、远红外及近红外的指纹区都有相应的特征吸收,因此,可通过红外光谱对其进行结构解析。

傅里叶红外光谱在合成填料过程中,通过比较键合前后基质的红外光谱,判别键合试验是否成功。

以反相色谱柱为例,填料通常通过其含碳量来表征表面化学修饰的程度。

高效液相色谱柱填料的含碳量在百分之几到百分之二十几之间,现代元素分析仪可测定化学键合硅胶中碳、氢和氧的含量,其测定极限约为0.2%～0.3%,完全可满足测定需要。

对于表面由单分子层修饰的基球,可通过含碳量及填料的比表面积计算修饰基的密度,进而对不同填料进行比较。

近年来,固体核磁共振波谱技术也应用于高效液相色谱固定相中,例如在无机基质表面键合C18制备反相色谱柱中,用13C标记C18修饰基团,从固定相的NMR谱中的δ16～40判别十八烷基是否键合到无机基质表面。

而δ115属于sp2杂化不饱和碳的核磁共振信号,可判别13C标记苯环修饰基团是否交联到无机基质表面。

3结语

色谱作为一种分离技术与方法,发展历经百年,特别是液相色谱,无论是从用途（制备型或分析型）、分离原理、基质材料,或是从发展史、分析应用、维护上细述,都是一门丰富的学问。

了解色谱材料的分类和分离原理,才可以理解色谱过程中一脉相承之处,例如固相萃取柱、固相微萃取探头涂层和液相色谱柱。

在食品问题、环境问题备受关注的今天,只有从事该行业的科研人员充分掌握了色谱的核心,才能使食品监管、环境监控及科研中的工作进行得更加迅速顺利。