周艳琴毕业论文双水相萃取技术分离菠萝酶的工艺研究Word文件下载.docx
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2.1.1材料5
2.1.2设备5
2.2实验方法5
2.2.1双水相体系的确定5
2.2.2相图的绘制5
2.2.3蛋白标准曲线的绘制7
2.2.4菠萝粗酶的提取8
2.2.5PEG/（NH4）2SO4双水相体系的建立8
2.2.6双水相萃取操作方法8
2.2.7菠萝蛋白酶酶活测定-G.D.U法9
3结果与分析10
3.1每g菠萝下脚料中含有的菠萝蛋白酶含量及菠萝蛋白酶的活性10
3.2不同分子量的PEG/（NH4）2SO4体系相图的制作10
3.3PEG的分子量对菠萝蛋白酶的分配系数、相比及酶活回收率的影响13
3.4PEG浓度对菠萝蛋白酶的分配系数、相比及酶活回收率的影响14
3.5（NH4）2SO4浓度对菠萝蛋白酶的分配系数、相比及酶活回收率的影响15
3.6外加盐NaCl浓度的不同对菠萝蛋白酶的分配系数、相比及酶活回收率的影响16
4讨论17
参考文献18
致谢19
双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究
生物工程专业周艳琴
指导教师谭海刚
摘要：
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质、肽、酯、酰胺，应用范围极广，而双水相萃取技术与传统的萃取技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，从而使其广泛应用于生物分离工程中。
本文研究了不同PEG分子量、PEG浓度、（NH4）2SO4质量分数以及外加盐等因素对菠萝蛋白酶酶活回收率、分配系数及相比的影响。
实验结果表明：
PEG平均分子量1000，浓度15%，（NH4）2SO4浓度14%，pH为7.0，室温的情况下，其分配系数达到3.30，酶活性回收率可达92.14%，相比为3.54。
当加入一定浓度NaCl不利于菠萝蛋白酶进入PEG相，对菠萝蛋白酶活性有一定影响，而加入MgCl2和CaCl2明显使菠萝蛋白酶活性降低。
关键词：
双水相；
聚乙二醇；
菠萝酶；
萃取
Studyontheextractionofbromelainbyaqueoustwo-phasesystem
StudentmajoringinBioengineeringZhouYanqin
TutorTanHaigang
Abstract：
Bromelainwastheacysteineproteinaseenzymewhichhadthemosttypicalandaverywiderangeofapplication.Itcoulddecomposeprotein,peptide,ester,amide.Aqueoustwo-phaseextraction（ATPE）wasanewtechnologywhichhadtheadvantageofmildoperationstate,largecapacity,continuousprocessesovertraditionalextractioninbiologicalseparation.soitcouldbewildlyusedinbio-separationengineering.Theeffectsofaqueoustwo-phasesystemandtheproportionintophasecomposition,operatingconditions,dilutingratioonbromelainactivitywerestudiedduringthispaper.InPEG/（NH4）2SO4two-phaseaqueoussystem,theeffectsofthemolecularweightofthePEGused,theconcentrationsofPEGandthemassfractionofPEG/（NH4）2SO4andotherfactorsoutsidethesaltdistributecoefficientofbromelainandtherecoveryofenzymeactivity.Experimentsshowedthat,averagemolecularweightofPEG1000,concentrationof15%,（NH4）2SO4concentrationof14%,pH7.0,thecaseofroomtemperature,thedistributioncoefficientof3.30,upto92.14%activityrecovery,foraddingacertainconcentrationofNaClhadlittleeffectontheactivityofbromelain,MgCl2andCaCl2tojointhebromelainactivitywassignificantlyreduced.
Keywords:
two-phaseaqueoussystem;
polyethyleneglycol;
bromelain;
extraction
1引言
菠萝蛋白酶，简称菠萝酶，英文名bromelain，编号EC3.4.22.33，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，等电点9.55[1]。
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、果皮、芽、叶、茎中，是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质、肽、酰胺。
菠萝酶是菠萝下脚料综合利用的重要产品之一，一种新的生物化学制品。
它主要是存在于菠萝植株中的蛋白质水解酶，一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取。
菠萝蛋白酶能分解蛋白质、肽、酯和酞胺，它的水解蛋白的活性较木瓜酶10倍以上。
经过大量的研究表明，菠萝酶有着广泛的用途，它可以抑制肿瘤细胞的成长并且作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的，而且它与木瓜蛋白酶不同，还可以水解纤维蛋白、酪蛋白及血红蛋白，使得纤维蛋白与血凝块溶解，改善体液循环，增加组织通透性，导致炎症，水肿和血肿的消退[2-3]。
在制革、食品、饮料等生产中应用很多，在医学上用之医治炎症等多种疾病，特别对橡胶脱蛋白效果也很显著，其水解蛋白质的活性大，适应性广。
在医学方面，将菠萝蛋白酶与各种抗生素（如四环素，阿莫西林等）联用，能提高其疗效。
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，它能促进抗生素在感染部位的传输，从而减少抗生素的用药量，可以用于各种原因所致的炎症、水肿、血肿、支气管炎、支气管哮喘、急性肺炎、乳腺炎等治疗。
与抗菌药物合用治疗关节炎，蜂窝组织炎，小腿溃疡，呼吸系统的各种炎症和尿路感染。
有一种复方菠萝酶片，含有菠萝酶和猪胆汁浸膏粉的肠溶衣片，除去肠衣后显灰棕褐色，是一种疗效不错的祛痰镇咳药[4-5]。
菠萝蛋白酶还具有嫩肤、美白去斑的优异功效。
菠萝蛋白酶可采用高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤法等方法进行提取，高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率低，但产品质量较好，纯度较高，产品酶活可达4.0×
106μ/g以上。
单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单，原材料消耗少，所需设备少，但酶活回收率较低，产品酶活力在3.5~4.0×
106μ/g之间。
超滤法生产工艺和操作比较复杂，且设备一次性投资大。
超滤浓缩后的浓缩液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取，可大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少，且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收率高，经济效益明显比传统工艺好[6]。
综合这几种方法来看，粗品种含有的残留的化学物质，不能满足食品级酶的质量要求。
相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取优势在于双水相体系可以为生物活性物质提供一个温和的环境，可在萃取过程中保持生物物质的活性及构象，且收率高、成本低、可连续化操作，应用前景非常广阔。
1.1双水相萃取分离技术
双水相萃取技术（Aqueoustwo-phaseextraction，简称ATPS），利用双水相体系，通过选择合适的成相与分配条件，使酶、蛋白质及菌体等生物大分子在两相中有不同比例的分配，从而实现其纯化，它是近年出现的、极有应用前途的新型生物化工分离技术。
双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作，设备简单，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，而且可直接与后续提纯工序相连接，无需特殊处理，特别适用于生物物质的分离和提纯。
因此近年来受到研究者的重视，尤其是它对生物活性物质的纯化分离能力更为研究者所关注。
双水相萃取技术是目前为止对生物活性物质纯化分离最有希望应用于大规模工业化生产的技术[8]。
1.2双水相形成机理
双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相水相体系。
从溶液理论上说来，当两种或多种有机物和水溶液相互混合时，是分层还是混合成一相，取决于混合时熵变问题和分子间的相互作用力两个因素，双水相体系的形成机理是盐析作用的结果[9]。
对于具体形成机理和溶液理论，有待于进一步探索。
1.3影响物质分配平衡的因素
双水相萃取法属于液-液萃取，物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量，其影响因素非常复杂，很难建立完整的热力学理论体系来研究其分配。
影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度、体系的pH、体系中的盐的种类和浓度、体系中菌体或细胞种类和浓度、体系温度等等[10]。
选择合适的条件，可以达到较高的分配系数，较好的分离目的物。
（1）聚合物的影响
聚合物对分配率的影响分为聚合物的平均分子量对分配率的影响和聚合物的浓度对分配率的影响。
PEG分子量的减少，会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大，由于成相聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加，当PEG分子量增加时，在质量浓度不变的情况下，其两端羟基数目减少，疏水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含PEG相中聚集而转向另一相。
（2）体系中无机盐离子的影响
在PEG/无机盐体系中，无机盐离子在两相中有不同的分配，因此在两相间形成电位差。
由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子产生很大影响。
（3）体系pH的影响
pH会影响蛋白质可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；
另外，pH还影响系统缓冲物的离解程度。
（4）体系温度的影响
温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活性。
一般的临近点附近，温度对分配率的影响较大，远离临近点时，影响较小。
（5）体系中微生物的影响
对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内蛋白质在体系中的分配系数。
1.4菠萝蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4双水相体系中的萃取原理
双水相萃取技术分离提纯生物物质，是基于被分离组分在两相间的选择性分配，其分配行为可由表观分配系数K来描述：
K=Ct/Cb（1-l）
式中Ct、Cb分别为上相和下相分配物质的浓度，单位为G/L
双水相萃取操作中，目标产物的回收率可用下列公式计算：
Y=RK/（l+RK）（1-2）
式中R为上下相的体积比。
K=Ct/Cb（1-3）
其中Ct、Cb分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
单位为G.D.U/mL。
如果菠萝蛋白酶主要分配在上相，菠萝蛋白酶酶的相回收率按下列公式计算：
Y=RK/（1+RK）（1-4）
其中R=Vt/Vb
如果菠萝蛋白酶主要分配在下相其相回收率按下列公式计算：
Y=l/（l+RK）（1-5）
1.5论文研究的主要内容
本文主要研究从菠萝下脚料中提取菠萝蛋白酶的实验，选定了PEG/（NH4）2SO4体系来进行双水相法提取菠萝酶的工艺研究，通过实验以不同的PEG分子量、PEG溶液浓度、（NH4）2SO4溶液浓度外加盐的种类及浓度对萃取菠萝酶以及菠萝蛋白酶含量的影响。
通过对体系上下相的酶活的测定，对相比、表观分配系数、酶活性回收率等参数的计算后作图，经分析后选择合适的体系，调节PEG和（NH4）2SO4的比例及浓度测定蛋白质的含量，分析各因素对PEG/（NH4）2SO4体系萃取菠萝酶以及蛋白质含量的影响，得出双水相体系萃取菠萝酶的最优工艺条件，为双水相技术在分离纯化菠萝酶中的应用提供理论依据。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1材料
菠萝下脚料广东黄登菠萝
甲醛分析纯中国医药集团上海化学试剂公司
NaOH分析纯天津市大茂化学试剂厂
PEG400分析纯天津市大茂化学试剂厂
PEG4000分析纯天津市大茂化学试剂厂
PEG6000分析纯天津市大茂化学试剂厂
PEG20000分析纯天津市大茂化学试剂厂
明胶分析纯莱阳市康德化工有限公司
（NH4）2SO4分析纯莱阳市康德化工有限公司
2.1.2设备
超声清洗仪江苏省昆山市曙峰企业
电热恒温水浴锅北京市长凤仪器仪表公司
高速离心机北京医用离心机厂
组织捣碎机上海比朗仪器有限公司
WFZUV-2100紫外分光光度计龙尼柯仪器有限公司
2.2实验方法
2.2.1双水相体系的确定
常见的双水相体系是高聚物/高聚物（或盐）体系。
在酶的分离纯化中最常见的体系是聚乙二醇/葡聚糖。
由于葡聚糖成本较高，因此选定聚乙二醇/盐体系作为研究对象，但由于PEG/（NH4）2SO4体系研究的相对成熟，且成本相对低，对工业应用具有很大意义；
因此在本实验中选定PEG/（NH4）2SO4作为提取菠萝酶研究体系。
2.2.2相图的绘制
相图是研究双水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示。
曲线TCB称为双节线，直线TMB称为系线。
双节线上方是两相区，下方为单相区。
所以组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
图1A-B-水双水相体系相图
Figure1ThephasediagramoftheA-B-H2Oaqueoustwo-phasesystem
操作步骤：
准确称取一定质量40%的PEG液体于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在搅拌混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。
记录盐溶液的加量（g）。
然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。
计算每次达到浑浊时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
表1相图制作表
Table1Thetableofmakingphasediagram
编号
水/g
（NH4）2SO4溶液加量/g
纯（NH4）2SO4累计量/g
溶液累计总量/g
（NH4）2SO4质量分数/%
PEG4000质量分数/%
1
0.5
0.357
0.129
1.25
10.3
12.8
2
0.3
0.238
0.215
1.84
11.7
8.7
3
0.179
0.279
2.35
11.9
6.8
4
0.365
2.87
12.7
5.6
5
0.494
3.73
13.2
4.3
6
0.623
4.64
13.4
3.4
7
0.752
5.54
13.6
2.9
根据表1数据以（NH4）2SO4质量分数为横坐标，以PEG质量分数为纵坐标即可做出相图。
2.2.3蛋白标准曲线的绘制
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色当与蛋白质结合后会变为青色，蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。
取6只具塞试管编号后按下表加入试剂，盖上塞子，摇匀。
放置两分钟后在595nm波长下比色测定。
以牛血清蛋白含量作为横坐标，以吸光度作为纵坐标，绘出标准曲线。
表2蛋白含量标准曲线制作表
Table2ThetableofProteinstandardcurve
管号
蛋白标准液（mL）
μ
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
0.2
考马斯亮蓝G-250（mL）
蛋白质含量（μg）
20
40
60
80
100
经过实验测得吸光度作图如图2。
图2蛋白质含量标准曲线
Figure2Standardcurveofproteincontent
2.2.4菠萝粗酶的提取
本实验采用超滤浓缩法提取菠萝粗酶：
称取一定质量的菠萝下脚料，按1：
3加入蒸馏水，用组织捣碎机将其榨成汁，用三层滤布过滤弃去残渣并收集上清液置于烧杯中，静置十分钟使其澄清取澄清液，将上清液倒于大离心管离心十分钟，弃去上清液，将沉淀转移至小烧杯中置于超声清洗仪中进行浓缩，将浓缩后的菠萝蛋白酶放在装有CaCl2的干燥器中干燥，即得到菠萝粗酶。
2.2.5PEG/（NH4）2SO4双水相体系的建立
将不同相对分子质量的PEG和（NH4）2SO4配制成一定浓度的溶液，准确称取一定量PEG溶液加入到试管中，然后加入（NH4）2SO4溶液混合至试管内开始出现混浊为止，离心分离成相即可得到PEG/（NH4）2SO4体系。
根据加入的PEG/（NH4）2SO4溶液的量算出PEG和PEG/（NH4）2SO4及水在系统中的质量百分浓度。
2.2.6双水相萃取操作方法
（1）将提取的菠萝粗酶称取2g配制成一定浓度的酶溶液备用，按比例准确称取一定量的PEG和（NH4）2SO4于带刻度的离心管中，加入1mL粗酶液，混合均匀后调平，静置10min，4000r/min离心10min。
（2）读取上下相体积及总体积，用1mL注射器分别取上、下相1mL，分别定容至100mL，测其酶活力及蛋白酶含量。
（3）测原酶液酶活力：
用移液管吸取1mL菠萝粗酶液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液酶活力（方法如2.2.6）。
（4）测蛋白酶的含量：
用移液管吸取1mL菠萝粗酶液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液蛋白酶含量（方法如2.2.3）。
2.2.7菠萝蛋白酶酶活测定——G.D.U法
（1）菠萝蛋白酶活性计算公式为：
酶活=l.4（H-B）/Ew=G.D.U./g
（2）酶活力测定步骤
A.消化
移取25.0mL明胶底物溶液于150mL锥形瓶中，将底物溶液置于水浴中，调节温度至45℃，加人1.0mL酶溶液，不停地搅拌此溶液，经过20分种消化后加入2滴过氧化氢溶液，然后借助pH计用0.1mol的NaOH溶液将其pH值调至6.0，再加入l0mL浓度为37%的甲醛溶液。
B.滴定
用0.1mol的NaOH标准溶液滴定至溶液pH=9.0时为终点，这时读取NaOH标准溶液的消耗量即为主值H。
C.空白对照
将底物溶液先置于45℃水浴中经过20分种消化后，加2滴过氧化氢溶液，再加人1.0mL酶溶液，其它步骤同主值H的测定方法，最后读取NaOH标准溶液的消耗量即为空白值B。
3结果与分析
3.1每g菠萝下脚料中含有的菠萝蛋白酶含量及菠萝蛋白酶的活性
利用G.D.U法测定菠萝蛋白酶粗品的活性为4.51×
106u/g，由于酶的活性容易受到影响，因此在提取过程中各种操作条件都会影响到酶的活性，在榨汁过程中局部温度过高会使酶得活性降低，超声清洗仪中的温度要设置合适，过高会使酶失活。
将提取的菠萝粗品置于冰箱中低温密封保存，以备后续试验待用。
取1mL菠萝酶粗品利用2.2.3步骤测得吸光度，经查图2的蛋白标准曲可知每g菠萝下脚料中含有的的蛋白酶含量为14.147mg。
3.2不同分子量的PEG/（NH4）2SO4体系相图的制作
PEG/（NH4）2SO4体系的相图是一条双结线，双结线的位置和形状与相对分子质量有关。
查资料可得，相对分子量质量越高，相分离浓度越低。
PEG/（NH4）2SO4体系中不同PEG分子量的相图如图3至图7。
图3PEG400/（NH4）2SO4体系相图
Figure3ThephasediagramofthePEG400/（NH4）2SO4system
图4PEG1000/（NH4）2SO4体系相图
Figure4ThephasediagramofthePEG1000/（NH4）2SO4system
图5PEG4000/（NH4）2SO4体系相图
Figure5ThephasediagramofthePEG4000/（NH4）2SO4system
图6PEG6000/（NH4）2SO4体系相图
Figure6ThephasediagramofthePEG6000/（NH4）2SO4system
图7PEG20000/（NH4）2SO4体系相图
Figure7ThephasediagramofthePEG20000/（NH4）2SO4system
从图3图至图7中可以看出，不同分子量的PEG/（NH4）2SO4溶液构成的双水相体系，其临界分相浓度有很大差别。
在图3中可以看出，PEG分子量越大，分相临界点越小，相分离所需的浓度越低；
两种聚合物相对分子质量相差越大，双节线的形成越不对称，成相物质浓度较少时即可分相，分相容易。
任何在同一系线上的组成，但分相后两相的组成相同，但两相的量不同，两相的量可按杆杠原理计算。
而在图4和图5中可以看出随着PEG分子量的增大，相分离所需的浓度越低，两种聚合物相对分子质量相差越大，双节线的形状越不对称，可能因为双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量有关。
物质在两相中的分配受表面自由能和表面电荷的影响
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