高中生物 第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序教案选择性高中选择性生物教案Word下载.docx

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温度上升到72℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。

④重复循环多次。

（4）结果：

每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n）。

二、基因表达载体的构建

1．构建基因表达载体的目的

（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

（2）使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成[填图]

3．基因表达载体的构建

首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。

三、将目的基因导入受体细胞

1．转化：

目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．目的基因导入受体细胞的方法

（1）目的基因导入植物细胞

①花粉管通道法

Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。

②农杆菌转化法

Ⅰ.农杆菌的特点：

农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；

农杆菌的Ti质粒上的TDNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。

Ⅱ.转化方法：

将目的基因插入农杆菌Ti质粒的TDNA中，让农杆菌侵染植物细胞。

（2）目的基因导入动物细胞

①常用方法：

显微注射法。

②常用受体细胞：

受精卵。

（3）目的基因导入微生物细胞

①方法：

用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。

原核细胞（使用最广泛的是大肠杆菌）。

四、目的基因的检测与鉴定

1．分子水平检测

（1）通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。

（2）从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。

2．个体水平鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。

基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。

判断对错（正确的打“√”，错误的打“×

”）

1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。

（√）

2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。

（×

）

提示：

Taq酶是耐高温DNA聚合酶。

3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。

（×

启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。

4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。

（√）

5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。

抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。

6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。

　获取目的基因和构建基因表达载体

1．利用PCR获取和扩增目的基因

（1）PCR反应的过程

（2）PCR技术与生物体内DNA复制的比较

比较项目

PCR技术

DNA复制

区别

解旋方式

DNA在高温作用下变性解旋

解旋酶催化

场所

细胞外（在PCR扩增仪内）

细胞内（主要在细胞核内）

酶

耐高温的的DNA聚合酶（Taq聚合酶）

DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等

温度条件

需控制温度，在较高温度下进行

细胞内温和条件

合成的对象

DNA片段或基因

DNA分子

联系

①模板：

均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成

②原料：

均为四种脱氧核苷酸

③酶：

均需要DNA聚合酶进行催化

④引物：

均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

2.基因表达载体的构建过程

（1）用同一种限制酶或产生相同末端的限制酶切割含目的基因DNA和质粒，使其产生相同末端。

（2）将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。

构建过程如下图所示：

合作探究：

（1）PCR过程中为什么需要引物？

引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。

存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应（PCR）之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。

（2）PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。

复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。

复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？

说明理由。

在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。

因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。

（3）在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？

第3轮

1．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述，错误的是（　　）

A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成

B．引物使Taq酶能从引物的5′端延伸DNA链

C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板

D．四种脱氧核苷酸为PCR提供能量和原料

B　[通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；

在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；

PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；

DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，同时两个核苷酸连接时可释放能量，D正确。

]

2．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是（　　）

①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子

②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA

③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止

④所有基因表达载体的构建是完全相同的

⑤必须在细胞内进行

A．②③⑤　　　　　　B．①④⑤

C．①②⑤D．③④

B　[基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还有启动子、终止子和标记基因等，①错误；

启动子是RNA聚合酶的结合位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；

终止子控制着转录的结束，③正确；

由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；

基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。

②③正确，①④⑤错误。

故选B。

3．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。

回答下列问题。

（1）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。

在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。

上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。

（2）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是___________________________________________。

[解析]　

（1）生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。

（2）在PCR过程中，要加热至90～95℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。

[答案]　

（1）解旋酶　加热至90～95℃　氢键

（2）Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活

4．（2020·

江苏高考）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以EcoRⅠ酶切为例）：

请据图回答问题：

（1）步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。

（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′羟基与5′磷酸间形成__________；

PCR循环中，升温到95℃是为了获得________；

TaqDNA聚合酶的作用是催化________。

（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）

已知序列

PCR引物

①5′AACTATGCGCTCATGA3′

②5′GCAATGCGTAGCCTCT3′

③5′AGAGGCTACGCATTGC3′

④5′TCATGAGCGCATAGTT3′

（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。

下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是________。

A．5′AACTATGCG┈┈AGCCCTT3′

B．5′AATTCCATG┈┈CTGAATT3′

C．5′GCAATGCGT┈┈TCGGGAA3′

D．5′TTGATACGC┈┈CGAGTAC3′

[解析]　

（1）根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（2）步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3′羟基和5′磷酸间形成磷酸二酯键。

PCR循环中，升高温度到95℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，TaqDNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。

（3）引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5′TCATGAGCGCATAGTT3′（引物④）和5′GCAATGCGTAGCCTCT3′（引物②）。

（4）分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5′端序列应为AATT，3′端序列应为TTAA，B正确。

[答案]　

（1）限制性内切核酸（或限制）　核苷酸序列　

（2）磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　（3）②④　（4）B

　将目的基因导入受体细胞

1．目的基因导入受体细胞的方法

受体细胞类型

方法

说明

特点

植物细胞

农杆菌转化法

将目的基因插入农杆菌Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达

经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物

花粉管通道法

在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达

简便、经济，我国科学家独创的一种方法

动物细胞

显微注射

技术

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物

将目的基因导入动物细胞最为有效的方法

微生物细胞

Ca2＋处理法（感受态细胞法）

用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子

简便、经济、有效

2.农杆菌转化法分析

（1）构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：

限制酶和DNA连接酶。

（2）基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。

（3）由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。

1.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？

说明原因。

能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。

2．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？

还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。

1．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是（　　）

A．培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因

B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法

C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法

D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法

A　[水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；

将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；

将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；

将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。

2．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA插入植物基因组中。

图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：

（1）剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是_______________，需用________“缝合”双链DNA片段的平末端。

（2）目的基因是指________。

由过程②形成的基因表达载体中，目的基因的上游具有________，它是________识别和结合的部位。

（3）过程③常用________处理使农杆菌成为感受态细胞。

抗生素抗性基因T的作用是________________________________。

（4）可通过________技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。

[解析]　

（1）Ti质粒具多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。

连接平末端应选用T4DNA连接酶。

（2）目的基因主要是指编码蛋白质的基因。

目的基因的首端具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。

（3）过程③常采用Ca2＋（CaCl2溶液）处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。

抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。

（4）检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用PCR技术。

[答案]　

（1）不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列

T4DNA连接酶

（2）编码蛋白质的基因　启动子　RNA聚合酶

（3）Ca2＋（CaCl2溶液）　用于鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌

（4）PCR

[课堂小结]

知识网络构建

核心语句背诵

1.基因工程的基本操作程序有：

（1）目的基因的筛选与获取；

（2）基因表达载体的构建；

（3）将目的基因导入受体细胞；

（4）目的基因的检测与鉴定。

2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。

3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。

4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。

5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。

6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法（Ca2＋处理法）。

1．基因工程主要操作步骤的顺序是（　　）

①基因表达载体的构建

②将目的基因导入受体细胞

③目的基因的检测与鉴定

④目的基因的获取

A．③②④①　　B．②④①③

C．④①②③D．③④①②

C　[基因工程的主要操作步骤顺序是：

目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器，对PCR过程中“温度的控制”的说法错误的是（　　）

A．酶促反应需要高的温度，是为了确保模板是单链

B．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度

C．DNA聚合酶具有耐高温的能力

D．DNA解旋酶具有耐高温的能力

D　[PCR是体外DNA扩增，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性，双链螺旋结构解体，双链分开，在复性后，在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。

3．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是（　　）

A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的

B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别

C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位

D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因

B　[由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。

4．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。

下列相关叙述正确的是（　　）

A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与

B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上

C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状

D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异

D　[重组质粒的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，DNA聚合酶一般用于DNA复制过程，A错误；

③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的TDNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；

如果受体细胞的染色体上含抗虫基因，只能说明抗虫基因成功整合到受体细胞的染色体上，不代表该基因就一定能表达成功，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；

⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异，D正确。

5．下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。

据图回答：

（1）获得A有两条途径：

一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；

二是根据目标蛋白质的________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。

（2）利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

（3）由A和载体B拼接形成的C通常称为________。

（4）在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是_____________。

[解析]　

（1）利用逆转录法合成目的基因的过程是：

以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；

根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：

根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。

（2）PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。

（3）目的基因和载体结合，形成基因表达载体。

（4）在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。

[答案]　

（1）逆转录　DNA聚合酶　氨基酸　脱氧核苷酸　

（2）引物　模板（A基因）　（3）基因表达载体　（4）使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态