用同源重组的方法进行基因修复Word文档格式.docx

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第一章同源重组技术的研究进展

1前言

1.1微生物育种技术概述

优良的菌株作为工业生产的基础，所以获得优良的菌株对于生物发酵或者产品生产都是至关重要，获得优良的菌株主要包括选种与育种两个过程，首先是选种，选种就是从天然的菌株中找到可以得到我们需要的生物分子或是有优良的生物特性的菌株，然后是育种，对已有的菌株进行遗传改良。

育种主要包括自然育种与人工育种两个方面。

（1）自然育种

对自然界中的微生物，在未经人工诱变或杂交处理的情况下进行分离和纯化（见微生物的分离和纯化），然后进行纯培养和测定（见微生物测定法），择优选取微生物的菌种。

这种方法简单易行，但获得优良菌种的几率小，一般难以满足生产的需要。

（2）诱变育种

以诱发基因突变为手段的微生物育种技术。

微生物育种技术包括物理的（如紫外线、γ射线、快中子等）和化学的诱变因素。

化学诱变因素分为3种：

①诱变剂与一个或多个核酸碱基发生化学变化，使DNA复制时碱基置换而引起变异，如羟胺亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亚硝基甲基脲等；

②诱变剂是天然碱基的结构类似物，在复制时参入DNA分子中引起变异，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤和2-氨基嘌呤等；

③诱变剂在DNA分子上减少或增加1～2个碱基，使碱基突变点以下全部遗传密码的转录和翻译发生错误，从而导致码组移动突变体的出现，如吖啶类物质和一些氮芥衍生物（ICR）等。

诱变育种操作简便，突变率高，突变谱广，它不仅能提高产量，改进质量，还可扩大产品品种和简化工艺条件。

如1943年从自然界分离到的青霉素产生菌的效价只有20单位/毫升，经过一系列的诱变育种后，效价已达40000单位/毫升；

金霉素产生菌经诱变后，发酵液中又积累了去甲基金霉素；

谷氨酸棒杆菌1299经紫外线诱变后，有的能产赖氨酸，有的能产缬氨酸，增加了产品的种类；

土霉素产生菌经诱变后，选到了能减少泡沫的突变菌株，从而提高了发酵罐的利用率。

诱变育种的不足是缺乏定向性。

（2）标号重复基因重组育种

基因重组育种就是把不同的两个或两个以上的生物遗传信息一起至于一个宿主细胞中，创建具有目的生物特性的重组柱。

具体的操作方法包括同源重组与杂交等。

1.2同源重组技术发展

1.2.1同源重组定义

传统意义上的同源重组指的是，发生在非姐妹染色单体（sisterchromatin）之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；

以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。

同源重组反应通常根据交叉分子或Holliday结构（HollidayJunctureStructure）的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holliday结构的拆分。

经过生物技术演变，同源重组成为了将外源基因与受体染色体NDA上的同源序列之间发生互换，从而改变受体基因的特定序列，并最终改变基因的遗传特性的方法［1］。

并在基因检测，重组基因表达方面有广泛的应用。

1.2.2同源重组的发展史

在1956年，加利福尼亚大学伯克利分校的A.JohnClark就对E.coli的重组进行了基因分析，并发现了与基因同源重组有关的酶RecA及RecBCD。

他们发现RecA蛋白质有两个键合位点，分别与单链挤双链DNA结合，在试管里能从某些小病毒里提取的单链DNA结合，这样以来，包裹着蛋白质的DNA就会“侵犯”完整的双螺旋DNA，把它的互补链分开，这个包裹蛋白质的链不断的试探着双螺旋结构，直到找到与它同源互补的序列，他就会插入到DNA的双链中，形成一个三链结构，如果有足够长的同源重组的序列，RecA就会被激活为一个交换型结构，催化链交换反应，最终形成一个新的双螺旋结构。

原来双螺旋结构中的一个互补链拋充了另外的配对链，RecA蛋白脱落。

由此而产生的结构叫做“D环”。

RecBCD蛋白的功能是从DNA双链的一段进入往DNA的另一端运动，在运动过程中他会将DNA的双链分开，并与此同时将分开的两个DNA单链绞在一起。

但是它的聚合速度比分离速度要慢，所以最终将会在DNA的两侧各形成一个不断增大单链DNA的环。

在某些情况下，RecBCD蛋白质不仅把DNA链分开，而且将他们切开。

生化实验表明：

RecBCD蛋白质使一段单链DNA和所在染色体分开，在RecA蛋白质的帮助在，这根自由的链和另一个染色体的一根链上的互补序列形成一个新的双螺旋结构。

1.2.3同源重组的应用前景

由于同源重组能按实验设计进行基因的定点突变，由此产生的转基因代替数对于研究基因结构与功能及表达调控具有极重要意义，通过定点突变而改变单个碱基或几个碱基导致核苷酸序列发生改变，从而改变该基因的功能。

例如，如果我们推测在弄得发育过程中包括有某一特殊基因的作用，这样我们通过基因打靶将正常基因“knockout”，而代之以错误的基因，这样导致正常基因的完全失活，如果具有这中基因结构的新生鼠有畸形的小脑，则我们可以确定这个基因是小脑发育正常所必需的基因。

绝大部分对小鼠ES细胞基因打靶的结果对于人基因结构和功能的研究具有重要意义。

1.3Red同源重组技术

1.3.1red同源重组技术的研究进展

Red重组系统是一种基于噬菌体Red重组酶的同源重组系统，Red同源重组系统由三种蛋白组合：

EXO蛋白是核酸外切酶，结合在双链DNA的末端，从5’端向3’端降解DNA，产生3’突出端，Beta蛋白结合在单链DNA上介导互补单链DNA退火，gam蛋白可与RecBCD酶结合抑制其降解外源DNA的活性，Red同源重组技术具有同源序列端、重组效率高的特点。

Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用K噬菌体Red重组酶的作用是导入细胞的线性DNA片段与染色体的特定扒啊序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。

［2］PCR引物由两部分组成，靠近5c端的区域为与把基因同源的序列（约40bp），靠近3c端的区域（约20bp）

与模版DNA互补。

这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。

这样，靶基因两翼序列已知的条件下就可以通过Red重组技术对该基因进行跳出、敲入、点突变等操作，还可在靶基因的上下有加入适当的启动子和中只字序列一条街基因的表达。

将含有ori复制序列的线性载体片段导入细胞，也可将靶基因克隆于载体上。

实验证明，这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。

1.3.2red同源重组的筛选以及标记基因的剔除

虽然Red同源重组的效率很高，但是在同源重组过程中还是会有许多的菌落未重组成功，这就需要标记基因的介入，就是将需要重组的基因连接在一个标记基因上，将其一起同组到大肠杆菌的基因组。

但是大肠杆菌中携带标记基因，这样就可能对重组菌以后的表达产生影响，所以标记基因的剔除也是同源重组中至关重要的一步。

一般通过以下四种方法完成标记基因的剔除：

（1）如果线性DNA中含有ori基因那么，可以一步筛选法将中间为筛选基因两端为同源序列的标记基因重组下来。

（2）筛选和反向筛选的结合使用，在第一步同源重组过程将两个标记基因导入到载体上，然后通过正向基因将其筛选出来，然后进行第二补同源重组，用反向标记基因筛选出重组成功的基因。

（3）筛选与位点特异性重组的结合，把筛选标记基因的两侧加上FLP位点，FLP位点具有特异性同组酶识别的作用。

应用此方法有一个缺点就是会在基因上留下34或36bp的特殊序列。

（4）筛选和限制性内切反应的结合，和第三种方法类似在标记基因的两次加上限制性酶切位点，然后利用酶切反应将标记基因切除。

1.4CRISPR介导基因的编辑技术

1.4.1CRISPR介导基因的编辑技术的研究进展

基因打靶，尤其是同源重组技术出现之后，无论是在科学研究，还是在工业生产上都有了革命性的变革。

但是同源重组技术仍有很有的弊端需要改进，尤其是重组菌株的筛选与筛选基因的敲出，这个过程使得同源重组产生过程复杂、效率降低以及工作周期长等弊端。

一种人工核酸内切酶的出现改变了这一现状。

［3］

锌指核酸内切酶（zincfingerendonuclease，ZFN）是人类所创造的第一代核酸内切酶，锌指是指的一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞转录因子中几乎有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白和核酸内切酶Fok1融合形成的核酸内切酶，利用他能够在各种复杂基因组的特定位置创造DNA的双链切口的这一特性。

它应用于黑长尾猴、小鼠、斑马鱼、果蝇、烟草、人类ips细胞甚至HIV的药物生产。

不过ZFN不是那么完美，它也有一些弊端，比如制备复杂，成本昂贵，最重要的是其专利被少数几个商业公司所控制，这样就会限制它在科研与生产方面的应用。

后来，第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶，它的出现在一定程度上替代了ZFN。

2009年，科学家将一种水稻的致病菌编码的累转录激活因子效应物与DNA的碱基进行了对应解密。

2010年，TALEN蛋白在成功应用于酵母之中。

TALEN可以像ZFN那样，对复杂懂得基因组进行修饰，另外他的构建简单，特异性强，受到了诸多科研工作者的喜爱。

ZFN和TALEN的工作原理相同，都是将DNA蛋白与核酸内切酶Fok1融合而成。

2013年，CRISPR/cas9出现，它主要根据大肠杆菌的自主免疫，然后将已有的基因进行改造而成。

其具有制备简单、成本低、作用高效等特点。

CRISPR序列是由日本科学家在大肠杆菌中首次发现的［4］,但是这段序列的功能无法被当时的科学界确定，因此它一直没有受到有关科研人员的重视，1995年，西班牙的科学家们在地中海极嗜盐菌和沃尔卡尼极嗜盐菌的研究中第二次发现这个结构，之后，此结构也被陆续报道，但是直到多种细菌的基因组测序完成之后，科学家发现这种串联重复结构在细菌和古生菌中存在非常的广泛。

科学工作者便开始对其的研究，并将其正式命名为CRISPR。

1987年，CRISPR被发现之后，它的作用一直以来就是一个谜团，不曾被人们破解，不过对着人们分子生物学研究方法的日益成熟，人们对基因序列的认识更加的广阔，以及大量的病毒和质粒的遗传信息的记录整理，CRISPR序列的功能最终被发现。

2005年，有3个研究小组同时发现了CRISPR序列中的间隔序列与宿主菌的染色体外遗传物质的高度的相似。

因此，科学家们推测CRISPR与抗外来基因入侵的自主免疫作用有关。

根据这个推测科学家们开始对其进行这一方面的研究，随后便发现细菌中的CRISPR可以对抗噬菌体的入侵，以及外来质粒的转移，并用实验证明了这一理论。

1.4.2CRISPR的原理

图1-1CRISPR工作原理

CRISPR/cas9基因编辑技术是ZFN和TALEN之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术是细菌以及古生菌中存在的Ⅱ型CRISPR/Cas基因进行改造而形成的。

它可以针对噬箘体感染、质粒接合所造成的基因侵入而形成的特异性的防御。

该过程分为3个阶段：

适应、表达和干扰。

（1）适应

当噬菌体DNA侵入菌体时，CRISPR系统就会知道合成cas蛋白，cas蛋白将对其DNA进行切割，使其形成无数个30bp左右的DNA片段。

然后将其整合到CRISPR导向序列之后重复序列之前的位置，使其形成一个新的spacer。

每次插入都伴随这重复序列的复制，这样就可以保证CRISPR中存在次噬菌体的序列信息，为适应性免疫做基础。

另外，科学家A.Bolotin研究发现，CRISPR位点中间区的个数越多对噬菌体的抵抗力就越强。

（2）表达

当同类噬菌体再次入侵该宿主菌时，CRISPR位点的转录水平就会迅速上升，生成重复序列和间区的前体pre-crRNA，之后被cas蛋白切成更小的crRNA，即成熟的crRNA.包括1个间隔序列和部分的重复序列。

每段的边距保持一致

（3）干扰：

crRNAs干扰入侵核酸

crRNP将会通过crRNA迅速寻找与其互补的DNA片段，并进行特异性结合，然后在复合体的作用下将其降解，从而达到保护宿主菌的作用。

第二章质粒ptarget的构建

1材料

1.1菌株和质粒

表1-1菌株和质粒

Table1-1Strainsandplamids

菌株和质粒

Strainsandplamids

基因型或表现型

Genotypeorphenotype

来源或文献

Sourceofreference

Strains：

E．coilDH5α

Plamids：

Ptarget-lacZ

Cloningofbacteria

博迈特

Biomed

Thislab

1.2培养基与常用溶液

1．2.1大肠杆菌培养基

LB培养基：

1000mlpH7.0（高压灭菌）

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

1.2.3常用缓冲溶液

TE（pH8.0）：

10mmol/Ltris-HCL（PH8.0）

1mmol/LEDTA（pH8.0）

1XTAE：

40mmol/Ltris-CH3COOH

1mmol/LEDTA

Gelsafe溶胶液1000ml

100ulgelsafe

定溶至1000ml

1.3酶、试剂和试剂盒

生化与分子生物学试剂购自原平浩试剂公司、上海生工生物公司、鼎国生物公司：

taq酶及PCR相关试剂购自TAKARA公司，化学试剂为分析纯，PCR引物由中美泰合合成。

核酸回收试剂盒QLAEXⅡ购自Qiagen。

1.4克隆中所用到的引物

根据wt-BL21上的突变位点，利用serialcloner分析软件设计合成下列引物：

引物

序列

长度（bp）

Tm（℃）

PF_aroF_apc

PF_gabD

（2）_spc

PF_gabD_spc

PF_gabT_spc

PF_lplA_spc

PF_talB_spc

PF_tnaB_spc

PF_tyrA_spc

TCCTAGGTATAATActagtCCCGGCGATAATATCTGAAAgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtTGTGGTTTGCGGCGGTAAAGgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtCAACTGGTTCAATTTGTTGAgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtCGGACGCAAAACTCACCGCCgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtCAAGTCTGGCGTTTTGTCCGgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtGCCAGCTCTTTCAGCAGTGTgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtCGAACTTATCCACAATACGCgttttagagctagaaatagc

TCCTAGGTATAATActagtGCCATGCTGGCGGCGCACGAgttttagagctagaaatagc

59

57.3

56.7

59.4

58.9

63.1

64.5

67.3

64.2

1.5仪器

C1000PCR仪

2方法

2.1PCR反应体系与反应条件

2.1.1Ptarget质粒的PCR

Q5反应体系100ul体系

5*Q5reactionbuffer20ul

10mMdNTP2ul

10uMFprimer5ul

10uMRprimer5ul

DNATemplate1pg~1ng

Q5DNApolymerase0.2ul1ul

5*HighGCenhancor20ul

ddH2O47ul

反应条件

98℃预变性DNA

30s

98℃变性

10s

47℃退火温度

72℃延伸

4个循环后

98℃变性10s

62℃退火30s

72℃延伸50s

30个循环后

72℃补充延伸5min

4℃保存forever

2.2凝胶回收

2.2.1琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物中加入5ul5Xsolutionbuffer后，调节电压150V，电流130A，点击star，开始电泳。

2.2.2切胶：

配置琼脂糖凝胶，电泳以分离dna片段，任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。

电泳时间足够后，在紫外灯下小心吧所需的DNA片段切下来。

并尽量去除多余的凝胶。

2.2.3凝胶回收

（1）将切割的凝胶转入预先称重的1.5ml离心管中，加入等体积的BufferGL（100mg的凝胶加入100μlBufferI）。

放入55-60℃水浴中，间断摇晃混合，直至凝胶完全融化（约5-10min），放置使其冷却至室温。

（2）将上述混合液加入DNA回收柱内，如果溶液体积>

700μl，分次转移溶液；

室温放置1-2min或更长时间。

13,,000g离心1分钟，弃废液。

目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心。

在DNA纯化柱中加入650μlWash 

Buffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。

（3）重复步骤2。

（4）13,000g离心3min，以去除柱中残余乙醇。

（5）将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃下预热的30μlddH2O，室温放置1-2min或更长时间。

2.3gibson

反应体系

Gibsonassembly

7.5ul

ddH2O

2.5ul

基因片段

5ng

反应条件

50℃

4℃

15min

forever

2.4将质粒Ptarget导入DH5α中

（1）加入5ul质粒加入BH5a细胞

（2）在冰盒上放置30min

（3）放在水浴锅上42℃，45s