中草药多糖的分离提取和理化性质研究Word文档格式.docx

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本次试验的材料为刺五加，采用水提法提取刺五加多糖，利用苯酚一硫酸比色法间对多糖含量进行测定，并依次利用薄层层析法、高效液相色谱法以及分子筛层析对刺五加多糖的理化性质进行分析。

1材料与方法

1.1实验材料

刺五加

1.2实验试剂

浓硫酸、葡萄糖、6%苯酚、标准样（木糖、半乳糖醛酸、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖）、三氟乙酸（TFA）、展开剂（正丁醇：

乙酸：

水=4：

1：

5）、显色剂（苯胺—邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸（HCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4·

2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·

12H2O）、无水乙醇（CH3CH2OH）、无水甲醇（CH3OH）、氯仿（CH3Cl）、超纯水、蓝色葡聚糖，重铬酸钾及相对分子量为15.3万，46.1万的葡聚糖标准品、生理盐水等。

1.3实验仪器

可见分光光度计、分析天平、离心机、SHIMADZULC-10AT（岛津）液相色谱仪、SHIMADZULC（岛津）色谱柱、层析缸、硅胶板（10×

10cm）、毛细管、喷雾器、烘箱、水解小瓶、蒸发皿、吹风机、层析柱1.5cm×

100cm、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测仪、记录仪、可见光分光光度计、容量瓶、移液枪、试管等。

1.4实验方法

1.4.1多糖的分离、提取与纯化

称取晒干的刺五加约30g，用蒸馏水浸泡约24h后，在80℃下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120℃下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。

醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。

1.4.2多糖含量测定

准确称取无水葡萄糖10mg，加少量蒸馏水溶解，后定容至于100mL，得葡萄糖标准液。

分别准确量取标准液0（0号管）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL于大试管中，补加蒸馏水至1.0mL。

向每只试管中加入6%苯酚0.5mL，混匀，再加入浓硫酸2.5mL，立即振荡，室温放置10min，以0号管为参比，于490nm测定光吸收值。

以葡萄糖的微克数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

准确称取多糖样品10mg，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至100mL，得到多糖溶液。

1号管中加入1.0mL蒸馏水，2、3、4号管中加入1.0mL多糖溶液。

分别向每个试管中加入6%苯酚溶液0.5mL，振荡混匀，浓硫酸2.5mL，立即振荡。

冷却10min后，以1号管作为参比，于490nm测定2-4号管的光吸收值。

所得三个数值取平均值，根据标准曲线计算样品中的多糖含量。

1.4.3糖组成分析

准确称取干燥的糖样5.0mg，加入1.0mL蒸馏水，充分溶解后转移至水解小瓶中，再加入1.0mL4MTFA，120℃水解5h。

将水解液平均转入2个蒸发皿中（其中一份用于薄层层析法测定单糖组成，另一份份用于高效液相色谱法测定单糖组成），向蒸发皿中加入适量无水乙醇，在水浴上蒸干，除去三氟乙酸。

用于薄层层析法测定单糖组成的一份水解样品，蒸干三氟乙酸后，加入1mL甲醇溶解蒸发皿底部的样品，用移液枪将其转移至1.5mL的塑料离心管中，待用。

将硅胶板水平放置，在距薄板一端2cm处用铅笔画一直线，在直线上，以1.0cm间隔打点作为点样位置。

并在每个点下方标明标样或样品名称。

分别点上标样及待测样品（水解后的多糖），待测样品点样量为10μL。

层析缸内加入展层剂，液面高度约为0.5cm。

将硅胶板在此密闭装置中展层。

观察溶剂跑至距硅胶板顶端约1cm时，从层析缸中取出硅胶板，记录溶剂前沿。

将硅胶板用吹风机吹干，然后用喷雾器向板上喷洒显色剂（苯胺—邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液），100℃烘箱中放置15min，即显现各斑点。

测量每个斑点中心距离加样原点的距离，计算相对迁移率（Rf值）。

通过与标准品单糖的Rf值比较，初步判断样品中含有的单糖种类。

用于高效液相色谱法测定单糖的一份水解样品，蒸干后加入0.5mL0.3M的PMP试剂和0.5mL0.3M的NaOH溶液，充分混匀。

取0.1mL样品置于1.5mL塑料离心管中，70℃水浴30min。

每组做5管。

待冷却后，取其中3个管，分别加入0.3M盐酸溶液0.05mL和超纯水0.05mL，充分混匀，将这3个离心管中的液体合并于其中一个离心管。

加入0.7mL三氯甲烷进行萃取，混匀后离心，弃去有机相（下层），保留水层。

重复萃取过程2次。

合并水层。

水层经0.22μm滤器过滤后，用HPLC进行单糖组成分析。

岛津LC-10ATvp泵，岛津SPD-10Avp紫外检测器，岛津色谱柱，流动相为PBS（0.1M，pH7.0）：

乙腈=82.2：

17.8（v/v），流速为1.0ml/min，自动进样，检测波长为245nm。

与标准糖样的各保留时间相比较，确定刺五加多糖可检测出Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Ara；

由于摩尔含量和峰面积成正比，故根据检测出的各种单糖的峰面积，可以计算得到刺五加多糖中各种单糖的摩尔含量比。

1.4.4相对分子量分布

将10mg样品（

标准糖样混合物为每种各取2mg左右，

待测样品）溶于1ml缓冲液中，离心除去不溶物质。

用SepharoseCL−6B柱层析法测定样品的相对分子量分布。

SepharoseCL−6B层析柱的条件：

层析柱流速为0.2ml/min，收集器调为15min/管收集。

洗脱柱中依次加入蓝色葡聚糖、重铬酸钾及相对分子量为15.3万的葡聚糖标准品混合物，相对分子量分别为7万和46.1万的葡聚糖标准品混合物，实验制备的多糖样品。

洗脱完毕，用苯酚-硫酸法测多糖的相对分子量分布。

2结果与分析

2.1粗多糖回收率测定

称取刺五加原样为30.3g，得到粗多糖样品为0.3662g。

所以，此次回收率为1.21%。

2.2多糖含量测定

图一葡萄糖标准曲线

待测样品

1

2

3

平均值

吸光值

0.250

0.257

0.280

0.2535

表一待测样品吸光值结果

由标准曲线公式y=1.2526+0.0690可以求得待测样品的浓度为0.0147mg/mL。

所以，提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%。

2.3薄层层析

测量每个斑点中心距离加样原点的距离，计算相对迁移率（Rf值）。

图二薄层法测定结果

样品

木糖

葡萄糖

阿拉

伯糖

甘露糖

半乳糖

半乳糖醛酸

5mL

10mL样品

15mL样品

总距离

距离

3.00cm

2.00cm

2.20cm

2.30cm

1.75cm

1.25cm

2.25cm

2.15cm

6.50cm

Rf

0.46

0.31

0.34

0.35

0.27

0.19

0.33

—

表二

由图表中可知，三种不同浓度的样品Rf值在0.30—0.35之间，与标准品单糖的Rf值比较，初步判断样品含有的单糖种类有葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖三种单糖。

2.4高效液相色谱

图三标准混样的高效液相色谱图谱

DetectorA（245nm）

Pk#

RetentionTime

Area

Height

Man

19.220

549765

20308

Rha

26.715

726090

20161

4

GalUA

32.510

876788

19488

5

Glc

39.603

568385

9976

6

Gal

45.512

1852460

30421

7

Xyl

47.266

1515474

24209

8

Ara

50.273

1477700

22244

表三混合标样的高效液相色谱分析结果

图四待测样品的高效液相色谱图谱

11

PMP

12.459

81678898

2808190

12

17.241

959521

37759

14

24.317

619152

13256

15

28.870

270192

5564

16

34.997

18363041

369220

17

40.068

3825279

70934

18

41.868

506664

9338

19

44.407

1241262

21191

表四待测样品的高效液相色谱分析结果

与标准糖样中各保留时间相比较，确定刺五加多糖中可检测出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7种单糖。

由于摩尔含量和峰面积成正比，故根据检测出的各种单糖的峰面积，可以计算得到其摩尔含量比为Man：

Rha：

GalUA：

Glc：

Gal：

Xyl：

Ara=4：

2：

71：

15：

5。

2.4SepharoseCL−6B层析柱测定相对分子量分布

柱高：

96.0cm

柱体体积=﹙1.5/2﹚²

×

π×

96.0＝169.56cm3

利用苯酚—硫酸法测定样品峰值，得到以下数据：

管数

体积

洗脱体积

蓝葡聚糖

19管

57cm3

重铬酸钾

53管

159cm3

15.3万葡聚糖

38管

114cm3

46.1万葡聚糖

28管

84cm3

27cm3

51管

153cm3

98cm3

表五

由公式Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）可得，

15.3万葡聚糖的Kav=0.51

46.1万葡聚糖的Kav=0.24

图五标准曲线

待测样品的Kav=0.87

所以，由标准曲线得知，待测样品的相对分子量为3.47万，即刺五加多糖的Mr为3.47万。

3讨论

本组通过水提法得到的刺五加粗多糖的回收率为1.21%，较其他组的回收率高，分析原因有两个，一是在浸提过程中我们组采用80摄氏度左右的火力加热，浸提时间也较长，使得刺五加中的成分更多地溶于水中，从而获得较多的粗多糖；

另外，在浸提过程中，过滤后的滤液中还是有很多不溶物，导致所得的样品较多。

在多糖含量测定中，利用苯酚—硫酸法提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%。

我们的三个待测样品中，有一个样品的数据较另外两个值较大，说明有较大偏差，因此平均值只用两个值求得。

利用薄层层析法分析单糖组成，初步判断样品含有的单糖种类有葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖三种单糖。

而高效液相色谱法分析单糖组成，与标准糖样中各保留时间相比较，可检测出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7种单糖。

可知，葡萄糖的含量最多，甘露糖的含量次之，其余五种单糖的含量较少。

两种方法相比较，高效液相色谱法更加灵敏、准确，但是薄层层析法的操作相对简单。

SepharoseCL−6B层析柱测定相对分子量分布测定多糖的相对分子量约为3.47万道尔顿。

在做标准曲线时，我们组只测出15.7万道尔顿和46.1万道尔顿大小的葡聚糖的峰，缺少7万道尔顿大小的葡聚糖的峰。

分析原因是可能7万的葡聚糖最后跑出来的含量太少，导致在利用苯酚—硫酸法测定该峰时，样液浓度较低，从而没有测出峰所在位置；

也有可能是我们组在测定峰值时操作存在问题导致没有测出7万葡聚糖的峰的所在管数。

另外，其他组的待测样品最终测出两个峰，即有两种多糖。

我们组只有一个峰，即只有一种多糖。

分析原因：

我们组的结果应该也至少有两种多糖，只是由于浓度太小而没有测出。

我们组在利用苯酚—硫酸法测定时，没有将所有的管都检测，只是有选择地进行测定，这个过程中必然存在遗漏，从而导致只测出一个峰值。

参考文献

［1］马　莉,唐健元，李祖伦,刘　毅,金　城,赵艳玲,肖小河等板蓝根多糖分离纯化及其性质的研究　ChineseTraditionalandHerbalDrugs　2007年8月第38卷第8期：

1143—1146

［2］孟繁磊,陈瑞战,张敏,陈瑞平等刺五加多糖的提取工艺及抗氧化活性研究食品科学2010,31（10）:

168—174