第五章--分子发光分析法(讲义).ppt
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第五章第五章分子发光分析法分子发光分析法（Molecularluminescenceanalysis）5-1概述5-2荧光分析法5-3磷光分析法5-4化学发光分析法化学与制药工程学院仪器分析分析InstrumentalAnalysis基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态。
当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
化学发光化学发光Chemiluminescence场致发光场致发光热致发光光致发光光致发光Photoluminescent磷光磷光Phosphorescence荧光荧光Fluorescence5-1荧光分析法分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
一、基本原理：
（一）、分子荧光（磷光）的产生：
室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。
处于基态的分子吸收能量（电能、热能、化学能或光能）后被激发为激发态。
激发态不稳定，将很快衰变到基态。
若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。
单重态，单重态，激发单重态，三重态：
激发单重态，三重态：
去去活活化化过过程程：
处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态。
由较高能态到较低能态的过程由较高能态到较低能态的过程（）（）其中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
其中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
E*E0化学反应非辐射跃迁发射光子去活化过程内转换ic外转换振动驰豫VR体系间窜跃isc荧光F荧光（单重单重，停10-9-10-6s）磷光P磷光（三重单重，停10-4-10s）去活化过程去活化过程：
、振动驰豫（、振动驰豫（VR）在同一能级同一能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。
其速率极大，10-1410-12s内即可完成。
、内转换（、内转换（ic）指相同多重态相同多重态的两个电子态之间（S2S1，S1S0）的非辐射跃迁。
当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。
如图中S2的较低振动层与S1的较高振动层相重叠，分子无论在哪一个激发单重态，都能通过振动驰豫和内转化跃回到第一激发单重态的最低振动能级。
12312V=03S0V=01S221V=0S12ic2VRiscFP1V=0T1VRiciscFP（3）、体系间窜跃（isc）指不同多重态的两个电子之间的非辐射跃迁。
它涉及受激发电子自旋状态的改变，如S1T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对，这种跃迁是禁阻跃迁。
含有重原子（碘、溴等）的分子中，体系间跨越跃迁最为常见。
在溶液中存在如氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生，因而使荧光减弱。
4）、荧光发射（Fluorescence）当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以10-910-6s左右的短时间发射一个光子返回基态。
这一过程称为荧光发射。
（单重（单重单重，停单重，停10-910-6s）发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小，即荧光荧光的特征波长的特征波长比它所吸收的特征波长所吸收的特征波长要长。
注意：
注意：
基态中也有振动驰豫跃迁。
31或2，不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为3的荧光。
（5）、磷光发射（Phosphorescence）从单重态到三重态的分子体系间窜跃发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低能层上，此时可能由两种途径返回基态：
体系间窜跃在10-410s左右时间内辐射跃迁回基态而发生磷光.这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。
（三重三重单重，停单重，停10-4-10s，液氮冷冻试样，才可见磷光），液氮冷冻试样，才可见磷光）荧光和磷光的根本区别荧光和磷光的根本区别:
荧光是由单重荧光是由单重-单重跃迁引起的，单重跃迁引起的，磷光则由三重磷光则由三重-单重跃迁产生的。
单重跃迁产生的。
观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻a.三重态与基态之间的能量差要比最低激发态和基态之间的能量差小，这使三重态与基态之间的振动偶合增强，因而增强了内部转换；b.激发三重态的寿命比激发单重态的寿命长，因而同溶剂分子碰撞而失去激发能的可能性增大，以致在室温条件下不能观察到溶液的磷光。
因此，观察磷光现象时，试样要用液氮冷冻以使碰撞去活化和振动偶合去活化降至最低限度12312V=03S0V=01S221V=0S12ic2VRiscFP1V=0T1VRiciscFP
（二）荧光的激发光谱和发射光谱1、激发光谱：
荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可从他们的激发光谱曲线来确定以荧光（磷光）的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图，即可得到激发光谱。
相对强度萘的激发光谱荧光光谱磷光光谱相对强度200300400500相对强度荧光或磷光光谱曲线荧光或磷光光谱曲线:
固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，将荧光的光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图便可得到荧光光谱（发射光谱）。
2、激发光谱和荧光光谱的特点：
（11）荧光光谱的形状与激发光波长无关）荧光光谱的形状与激发光波长无关荧光物质吸收不同波长的激发光可被激发到不同能态，通过振动驰豫和内部转换最终都将达到第一激发单重态的最低振动能级，然后再发射荧光。
故蒽的激发光谱虽在250nm和350nm有两个峰，不论用哪一个峰的波长作激发光源，所得荧光光谱的形状和峰的位置都是相同的。
（2）荧光光谱和激发光谱成镜像关系荧光光谱和激发光谱成镜像关系从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成镜像对称a.荧光光谱（发射光谱）形状与基态S0振动能级的分布情况（即能量间隔情况）有关b.激发光谱（吸收谱）形状与激发态S1振动能级的分布有关c.S0、S1态中振动能级的分布是相似的（说明峰形状相似）d.根据Frankcondon原理，电子跃迁过程中核的相对位置不变（近似的），若吸收光谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最大（说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。
（3）荧光光谱波长）荧光光谱波长em大于激发光谱波长大于激发光谱波长ex斯托克斯（Stokes）于1852年首次观察到荧光光谱波长em大于激发光谱波长ex这一现象（称斯托克斯称斯托克斯位移位移）。
它说明激发与发射间有一定能量损失。
产生的主要原因是激发态分子发射前后都存在振动弛豫现象。
例例:
区别谱图中的区别谱图中的三个峰，说明判断三个峰，说明判断原则原则。
（三）、荧光效率及其影响因素：
1、分子产生荧光必须具备的条件：
、分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；、吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率（荧光效率）、荧光效率荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强。
、荧光效率也可用各种跃迁的速率常数来表示Kf：
表示荧光发射过程的速率常数，主要取决于物质的化学结构；：
表示非辐射跃迁的速率常数之和，主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。
2、荧光效率3、荧光效率的影响因素：
、分子结构：
、分子结构：
a、跃迁类型跃迁类型：
实验表明，大多数荧光化合物都是由*或n*跃迁激发，然后经过VR或其它无辐射跃迁，再发生*或*n跃迁而产生荧光。
其中*跃迁的荧光效率较高。
原因原因：
的较大（比n大100-1000倍），其次，寿命约10-710-9s（比n寿命10-510-7s短），此外，在过程中，体系间窜跃至三重态的速率常数也较小，这都有利于荧光的发射。
b、共轭效应、共轭效应：
含有*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强；这种体系中的电子共轭度越大，则电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光，而且荧光光谱将向长波移动。
所以绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环。
对苯基化、间苯基化和乙烯化作用都将增加苯的荧光强度，并使荧光光谱红移。
cc、刚性平面结构刚性平面结构：
此结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，也就减少了碰撞去活的可能性，有利于荧光的产生。
例例1：
荧光素有很强荧光，但酚酞无，是由于荧光素的刚性可减少分子振动例例2：
芴和联苯在同样条件下的荧光效率约为1.0和0.2。
芴上的亚甲基增强了分子的刚性。
此外，当荧光染料吸附在固体表面上时，常使荧光发射增强，这可用固体表面诱导了分子结构的附加刚性来说明。
例例3：
刚性的影响可说明螯合剂同：
刚性的影响可说明螯合剂同M螯合时荧光增强的螯合时荧光增强的现象。
现象。
滂铬兰黑滂铬兰黑RR（BBRBBR）无荧光，它与铝形成螯合无荧光，它与铝形成螯合物有荧光。
物有荧光。
d、取代基效应：
给电子取代基使共轭体系增大，使荧光增强，如OH，NH2，NR2，OR，CN。
吸电子取代基使荧光减弱甚至会猝灭荧光，如COOH，NO，NO2，C=O，卤素离子等。
同电子体系相互作用小的取代基（SO3H，NH3+和烷基），对分子发光影响小。
重原子效应重原子效应：
将一高原子序数的原子引入到电子体系中去，往往会使物质的荧光减弱，而磷光增强。
重原子效应重原子效应：
若使用含重原子的溶剂，也会发生外部重原子效应，导致磷光增强和荧光减弱。
如卤素取代基荧光的相对强度氟代苯10氯代苯7溴代苯5碘代苯0原因：
因为在原子序数高的原子中，电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，更有利于电子自旋的改变，增大了体系间窜跃，而使荧光减弱，磷光增强。
、环境因素：
、环境因素：
A、溶剂的极性溶剂的极性：
极性增加，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。
B、温度温度：
辐射跃迁的速率基本不随温度而变；非辐射跃迁的速率随温度升高而显著地增大；因此，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
C、pH值值：
影响酸性、碱性取代基团的存在型体，应严格控制pH。
如苯胺在pH=712时以分子型体存在，发兰色荧光，而pH小于2、pH大于13时以离子形式存在，不发生荧光。
D、表面活性剂表面活性剂：
增大荧光效率E、顺磁性物质、顺磁性物质：
减小荧光效率如O2。
（四）荧光强度同浓度的关系（四）荧光强度同浓度的关系1、荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率。
If=Ia据Beer定律：
Ia=I0-It=I0（1-10-A）代入上式得：
If=I0（1-10-A）=I0（1-10-bc）若溶液很稀（A0.05），则可近似为If=2.3I0bc对于一给定的物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关。
If=Kc荧光强度与荧光物质的浓度成正比荧光强度与荧光物质的浓度成正比2、高浓度偏离线性关系的因素：
、高浓度偏离线性关系的因素：
a.当浓度较浓，不满足A0.05，公式近似处理误差大（如果a=104，b=1.0代入abc0.05得c=5.010-6mol/L）b.自猝灭（Self-quenching）由荧光分子间以及荧光分子同溶剂分子间的碰撞产生的。
c，自猝灭。
c.自吸收（Self-absorption）发生在荧光发射波长同化合物的吸收峰重迭的情况下，当荧光通过溶液时便被吸收一部分。
3、影响荧光强度的因素：
内滤光作用和自吸收现象：
溶液中若存在着能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱。
荧光物质的荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠，在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。
荧光猝灭（荧光熄灭）：
荧光猝灭（荧光熄灭）：
广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。
狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。
荧荧光光猝猝灭灭剂剂：
与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强
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