本科生毕业论鸡马立克的分离鉴定.docx
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本科生毕业论鸡马立克的分离鉴定
本科生毕业论文
毕业论文题目鸡马立克氏病病毒的分离与鉴定
学生姓名虞思聪
所在学院兽医学院
专业及班级动物医学动医1202班
指导教师钱琨
完成日期2016年6月1日
目录
摘要3
综述4
1.病原学5
1.1病原特性与分类5
1.2病毒培养5
1.3致病性5
2流行病学6
2.1传染源6
2.2传播途径6
2.3易感动物6
2.4潜伏期6
正文7
1.材料与方法7
1.1病鸡临床症状7
1.2材料与试剂7
1.3发病鸡的剖检8
1.4琼脂扩散试验8
1.5病毒分离8
1.6间接免疫荧光试验8
1.7病理切骗诊断9
1.8聚合酶链式反应（PCR）9
2.结果11
2.1剖检结果11
2.2琼脂扩散试验结果11
2.3病毒分离结果11
2.4间接免疫荧光结果12
2.5切片观察结果12
2.6PCR检测结果14
3.讨论16
致谢18
参考文献18
鸡马立克氏病病毒的分离与鉴定
动物医学动医1202班：
虞思聪
指导老师：
钱琨
摘要：
本研究旨在对鸡马立克氏病病毒进行分离与鉴定。
马立克氏病通常爆发于10-12周龄，但本文中是一例爆发于15-16周龄已免疫马立克疫苗的种鸡群的马立克氏病。
本次实验的病料取自江苏某大型养鸡场，通过病理切片、琼扩试验和PCR检测证实确为马立克氏病。
由以上结果可知，马立克氏病现在的发病时间段在慢慢延长，对马立克氏病的监控与防治日益重要。
关键词：
马立克氏病病毒；病毒分离；病理切片；聚合酶链式反应（PCR）
IsolationandidentificationofchickenMarek'sdiseasevirus
Student:
SicongYu
Advisor:
KunQian
Abstract:
TheaimofthisstudywastoisolateandidentifythechickenMarek'sdiseasevirus.Marek'sdiseaseusuallybrokeoutat10-12weeksofage,Butthisisacaseofoutbreakin15-16weeksofMarek'sdiseasevaccineimmunechickenshavebeeninfected..TheexperimentalmaterialistakenfromalargechickenfarminJiangsu,throughthepathologicalsection,agardiffusiontestandPCRtestconfirmedthatMarek'sdisease.Fromtheaboveresults,wecanknowthattheincidenceofMarek'sdiseaseisnowslowlyextended,themonitoringandpreventionofMarek'sdiseaseisincreasinglyimportant.
Keywords:
Marek'sdiseasevirus;virusisolation;pathologicalsection;polymerasechainreaction（PCR）
综述
马立克氏病（Marek’sdisease，MD）又名神经淋巴瘤病（neurolymphomatosis），是是由鸡马立克氏病病毒（MDV）引起的一种鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病。
发病特征为对外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单个或多个组织器官发生单核细胞浸润。
这种病是由细胞结合性疱疹病毒引起的传染性肿瘤病，导致各种不同的器官和组织形成肿瘤。
病鸡常见的情况有体重减轻、肢体麻痹瘫痪，急性死亡的症状也会常常发生。
在病原学上与鸡的其他淋巴样肿瘤病有所不同。
在1907年，匈牙利的马立克氏（JosefMarek）第一次公开报道了这种病症，为了纪念他的肿大发现，Biggs氏在1961年建议用马立克氏的名字命名此种病症，目前世界各地的养禽业都被马立克氏病或多或少地困扰着。
中国从70年代开始也发现了马立克氏病在养禽业中有大规模的流行现象。
尽管接种疫苗在其防控中起到重要作用，也受到很大的重视，但在一些国家MD仍然时有发生，甚至在一些免疫鸡群中也有发病[1]。
很多时候这种病的爆发也有人为原因，比如说疫苗在保存运输中损坏或者使用方法不当。
由于不按要求及时检查，添加液氮而造成液氮罐中的疫苗失效。
由于活细胞死亡，其中的病毒也会因此很快死亡，这样就造成疫苗效价大大降低。
因此派遣专人负责保管疫苗很重要，并且需要及时添加液氮。
从液氮罐中提取疫苗前，检查疫苗是否浸泡在液氮中。
在需要使用疫苗时，每次只允许提取出单只疫苗，尽量减少其暴露在空气中的时间，并且迅速在准备好的温水中速融，其他一些情况也会造成部分疫苗效价降低或失效，例如融化温度，稀释液温度，注射等操作不规范。
所以我们还需要定期检查。
对假定健康鸡群，用琼脂扩散等方法定期检查马立克氏病毒，被马立克氏病感染过的鸡群用沉淀抗原和阳性血清进行定期检查，如若有鸡被检查出有阳性反应应该及时淘汰
直至1970年左右预防本病的疫苗才终于研制成功，在此之前，MD造成的经济损失是惊人的。
死亡率一般为10%-60%，产蛋鸡死亡率甚至可高于60%，而肉鸡的淘汰率则高的10%，低的10%以下，甚至有鸡群全群发病以致全部应予淘汰的情况。
美国1956-1966年，约有饲养总数的2.3%的鸡死于马立克氏病，达到了惊人的3.9亿只。
在1965年，马立克氏病在美国肆虐，让其亏损了6500万美元。
10年之后的1975年，在已经制备出疫苗的情况下仍然损失了2亿美元。
在欧洲，MD也有大规模感染的现象，在1965年，英国损失4000万美元，1969年损失了1500万英镑。
在其他地区，1973年的印度由于MD的原因损失了4000万卢比，1965-1973年的丹麦每年都因此损失10-100万美元。
到了1984年，全世界在马立克氏病上的损失保守估计达到了9.34亿美元。
就算到1980年以后欧洲部分地区的MD死亡率仍然为25%-40%[2]。
不同品种的鸡由于易感性不同，病毒毒力高低的差别，死亡率也有很大的不同。
比如一种洛红岛红鸡，在对其进行了人工感染试验后发现，它的易感性高的惊人，一旦感染了超强毒力的MD毒株，100%死亡。
感染原型强毒株的死亡率为43.8%-68.8%。
而抗病强的品种如N系鸡对超强毒株的死亡率为62.5%-87.5%，对原型强毒株几乎为0[3]。
对马立克病的研究对兽医学、基础科学和比较肿瘤学研究均很有意义。
该病发病机制非常复杂，肿瘤和炎症之间相互作用表现出几种不同的临床症状，每种症状随宿主的遗传特性而不同[4]。
MD疫苗接种是兽医史上成功控制疾病的一个突出事例，而且MD疫苗是所有物种中能有效控制癌症的第一个疫苗，因此对于今后癌症控制的研究有一定的启发性。
我国于70年代初发现本病，随着养鸡业向集约化方向发展，目前绝大多数养鸡地区都有本病流行，受害鸡群的发病率从少数几只鸡到20%或30%不等，或可高达60%。
在鸡群密集的地区和甘规模经营的鸡场MD常成流行性。
有些地区经多年使用疫苗，MD基本得到了控制，另一些地区近年来发病则有上升趋势。
当前的损失虽然不是很严重，但本病意外暴发的可能性仍然存在，并随着MD病毒毒力不断增强可能使疫苗免疫失败，再次导致严重损失[5]。
对马立克病的研究对兽医学、基础科学和比较肿瘤学研究均很有意义。
该病发病机制非常复杂，肿瘤和炎症之间相互作用表现出几种不同的临床症状，每种症状随宿主的遗传特性而不同。
MD疫苗接种是兽医学上成功控制疾病的一个突出事例，而且MD疫苗是所有物种中能有效控制癌症的第一个疫苗，因此对于今后癌症控制的研究有一定的启发性。
近年来应用MD疫苗证明是防制鸡马立克氏病的主要方法,使MD的发病率大幅度下降，有少数发病率在10%以上。
但由MD造成的经济损失依然是非常大的，所以我们仍然需要进一步研究。
1.病原学
1.1病原特性与分类
马立克氏病毒又称禽疱疹病毒Ⅱ型，是一种细胞结合性病毒，具有双股DNA，属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科。
马立克氏病毒外形近似球形，结构上为二十面体对称。
虽然MDV属疮疹病毒科（Herpesviridae）的Y疤疹病毒亚科,但其有着类似于A疤疹病毒亚科的病毒的分子结构和基因组成。
一条线性的双股DNA分子构成了MDV的核酸,分子量为108一120x106道尔顿,相当于160一180kb的大小,在氯化艳中浮密度为1.7069/ml,碱基G+C的百分比为43.9%。
MDV的基因组DNA由大小不同的两个单链环通过一个双链臂连接而成,两个单链分别来自长单一序列和短单一序列,双链臂由末端长、短反向重复序列与相应的内部长、短反向重复序列互补而成[6]。
在机体组织内病毒有两种存在形式：
裸体病毒:
病毒颗粒外面无囊膜，属严格的细胞结合型病毒，存在于肿瘤组织中；完整病毒：
病毒颗粒外面有囊膜，属非细胞结合型，存在与羽毛囊上皮细胞中。
完整病毒对外界具有较强的抵抗力，但热的抵抗力不强，对福尔马林敏感[7]。
分三个血清型：
血清Ⅰ型（含强毒及致弱的变异毒株）；血清Ⅱ型；火鸡疱疹病毒及其变异株（HVT）
血清Ⅰ型（MDV1）是这群禽类病毒群的原型毒株，MDV一般是指血清Ⅰ型病毒。
血清Ⅰ型病毒株还可分成四个病理型：
温和型MDV（mildMarek’sdiseasevirus，mMDV）、强毒型MDV（virulentMarek’sdiseasevirus，vMDV）、超强毒型（veryvirulentMarek’sdiseasevirus，vvMDV）及特超强毒型（veryvirulentplusMarek’sdiseasevirus，vv+MDV）。
血清Ⅱ型病毒是从正常鸡体内分离到的无致病性毒株，依据荧光抗体试（FA）和琼脂扩散试验（AGP）将其归为一个独立的血清型。
自然感染这种毒株可产生抵抗MDV攻击的保护性免疫，因此现作为疫苗广泛使用。
火鸡疱疹病毒（HVT）是从正常火鸡体内分离到的。
该病毒呈地方流行性，普遍存在于家养火鸡中，该病毒对火鸡无致瘤性，一般不能在未受损的或有免疫抑制的鸡中引起临床症状，且对免疫应答没有不良影响。
但若给予很高剂量，可出现法氏囊和胸腺的萎缩及神经组织中少量细胞浸润。
现在HVT已广泛用于对1日龄雏鸡进行疫苗接种以预防MD[8]。
1.2病毒培养
本病毒可在新生雏鸡、组织培养、鸡胚和MD淋巴瘤成淋巴细胞样细胞系中增殖。
鸡肾细胞和鸭胚成纤维细胞培养，适合于MDV的增殖，形成局灶性细胞病变，损害的细胞上常看到A型核内包含体。
鸡胚经卵黄囊接种MDV后，经过12～14天在绒毛尿囊膜上发生病毒痘斑。
但这种方法成本较高，见效比较慢，所以本次实验中采用了次代鸡胚成纤维细胞接种培养的方法。
1.3致病性
MDV主要侵害雏鸡和火鸡，年龄越小敏感性越高，例如有研究发现，初生雏鸡对此病的敏感性在14日雏鸡一千倍以上。
野鸡、鹌鹑和鹧鸪也能感染。
发病后不仅引起大量死亡，耐过的鸡也会有生长不良，是一种免疫抑制性疾病，对养鸡业危害极大。
MD病情复杂，可分为4种类型:
内脏型（急性型）、神经型（古典型），眼型和皮肤型。
1.内脏型（急性型）：
内脏器官产生大量肿瘤，没有明显的特征性症状，发病快且迅猛，病程短，有着很高的死亡率。
对性腺的影响最明显，也最多见。
除此以外，肾、脾、肝、心、肺、肠系膜、腺胃、肠道肌肉组织等也会出现大小不等、质地坚硬、呈灰白色的肿瘤块。
之后肿瘤会呈弥漫性增长，感染器官日益肿大。
2.神经型（古典型）：
多见于弱毒感染或HVT免疫失败的青年鸡（2~4月龄）主侵害外周神经，造成不全或完全麻痹。
可以同时发生在机体一个或数个部位，在两翅和两腿上最为常见，但大多只发生在一侧。
受害部位会出现明显的神经肿大，增粗2~3倍，看上去像在水中浸泡过，大多为黄（灰）白色，分辨不出纹理或者纹理完全消失，可以与对侧完好神经进行对比，有助于鉴别。
3.眼型：
虹膜上的色素几乎完全消失，瞳孔变为灰色，包括灰眼，鱼眼、蛤蟆眼。
同时瞳孔边缘变得不规整，可以发现其视线有明显的迟钝，严重者出现失明。
4.皮肤型：
此种病型仅在宰后拔毛时发现羽毛囊肿大，形成结节或瘤状物,此种病变常见于躯干、背、大腿生长粗干羽毛部位。
皮肤病变以羽毛囊为中心，呈半球状突出于表面，或融合呈丘状。
致病的严重程度与病毒毒株的毒力、鸡的日龄和品种、免疫状况、性别有很大关系。
隐性感染鸡可终生带毒并排毒，其羽毛囊角化层的上皮细胞含有病毒，易感染鸡通过吸入此种毛屑感染。
MDV不经卵传递。
一般认为哺乳动物对本病毒无易感性。
鸡一旦感染会长期带毒排毒，造成很大危害[9]。
2.流行病学
2.1传染源
马立克氏病由病鸡和带毒鸡进行传播，病毒存在于它们的血液，肿瘤和羽毛囊上皮等，以羽毛囊上皮的传播作用最为重要。
除此以外，病毒可以混合在脱离的角化毛囊上皮、灰尘等污染物中，它们也会变成重要的传播媒介。
2.2传播途径
高度接触传染，主要是呼吸道，其次为消化道。
鸡群间通过空气传播，直接或间接接触很容易传播MDV，鸡羽毛囊角质层的上皮细胞中可复制出具有完全感染性的病毒，这些细胞成为对环境及其他鸡的污染源。
与羽毛和皮屑结合的病毒是有感染性的，污染的禽舍灰尘在20～25℃下至少几个月有感染性、4℃下数年仍有感染性。
在商业化饲养的情况下，小鸡的成长很可能暴露于MDV下。
育成鸡舍的灰尘，皮屑等或是来自其他鸡舍的污染物和人员都可能携带病毒。
一旦病毒进入鸡群，不论鸡群的免疫情况如何，传播都是非常迅速且难以发现及遏制的。
接触病毒后两周内感染鸡就会开始排毒，变成新的传染源，3-5周后排毒达到高峰。
感染鸡若不及时处理，会终身排毒[10]。
甲壳类动物，如黑甲壳虫也会被动携带病毒进行传播，需要管理人员做好清理工作。
另外，MDV不能垂直传播，禽类孵化时的温度和湿度都不适宜病毒的存活。
所以，子代鸡不可能因为母代鸡的感染而感染[11]。
2.3易感动物
对鸡（尤其是集约化程度高的埸）危害最严重。
多见2--5月龄鸡，应注意MD发病日龄的提前和延后。
除此以外，鹌鹑、火鸡和山鸡等可发生自然感染MD，但较少发生疾病现象，危害不大。
2.4潜伏期
人工感染引起的MD，大约感染两周后可见神经和其他器官的单核细胞浸润，但一般要到第三周和第四周才出现临床症状和甘体病变。
MDV感染引起的几种非淋巴瘤综合征的潜伏期可能较短。
溶细胞感染见于感染后3～6天，在6～8天后伴有胸腺和法氏囊的萎缩，8～14天会出现早期死亡综合征。
临床上，最早有3～4周龄的非免疫产蛋鸡暴发本病。
甘多数严重病例都从8或9周龄开始，而且有时要到开产后才发病。
在免疫的商品鸡群中MD的暴发是由于疫苗的明显免疫失败不能提供保护。
现在实践中很难判断新发疾病是早期感染的还是新近感染的，但在某些条件下，MD淋巴瘤的潜伏期可能会达到几个月或几年。
正文
1.材料与方法
1.1病鸡临床症状
发病鸡来自江苏某大型养鸡场，在110龄初发病时在鸡群中发现有消瘦鸡只，进行剖检后可以看见肿瘤现象。
之后发生肿瘤比率不断增加至产蛋高峰期，发病高峰时肿瘤发生比例也到了最高点5%，之后开始减少。
病鸡剖检情况：
肝脏、脾脏有大量肿瘤，其次在肾脏也出现肿瘤。
在发病高峰期时，几乎所有内脏、皮肤均可见到肿瘤。
1.2仪器与试剂
主要仪器：
恒温干燥箱购于上海实验仪器总厂，SW-CJ-1F型单人双面超净工作台购于苏州净化设备有限公司，PCR仪由基因有限公司ABI厂家生产，型号为2720，JunYiJY200C型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）;凝胶成像系统（美国UVP公司，76-0312-02）。
主要试剂：
DMEM和犊牛血清为GIBCO公司产品,MDVGB单抗BA4为本室制备保存，FITC标记羊抗鼠IgG二抗为SIGMA公司产品,LATaqDNA聚合酶、DL2000DNAMarker等购自大连宝生物工程有限公司,dNTPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.3发病鸡的剖检
在剖检之前，先在鸡翅静脉上无菌操作采集病鸡抗凝血液约500微升，用滴管往10毫升离心管中缓慢加入稀释后的血，离心管中先加入等量淋巴细胞分离液，之后2000rpm,离心20分钟，离心后可见中间有一层白色云雾状物质，此为淋巴细胞。
之后用滴管取出这些淋巴细胞置于另一个干净离心管，再用体积为5倍以上的PBS洗涤这些细胞，洗涤2次，每次1000rpm，离心10分钟。
弃去PBS，用适量的DMEM重悬细胞，再接种次代鸡胚成纤维细胞（CEF）,在37℃，5%CO2的培养箱中培养3小时后，弃去上清液，用PBS润洗2遍，加入1%胎牛血清的DMEM继续培养常规剖检病鸡，观察病鸡的外观、皮肤以及内脏器官的病变。
1.4琼脂扩散试验
鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验，检测对象包括：
血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓中马立克氏病病毒抗原。
其操作方法如下：
1．琼脂糖平板制备采集病鸡血清及带羽髓的羽囊后,用PBS配制1%含8%的NaCl琼脂板涌0.01MpH7.4的PBS配制1％琼脂糖溶液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打孔器准确打孔，加热封底。
2．检测血清抗体中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗原，周边孔滴加待检血清，抗原和血清的加入量以加满而不溢出为度。
样品加毕后，将琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育48h后，观察并记录结果。
测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。
3．检测抗原中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓浸液，即在试管内加入1～2滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。
加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，48h后观察结果。
1.5病毒分离
初次分离MDV的最常用的方法是用血液淋巴细胞或感染鸡淋巴组织的单细胞悬液接种易感的组织培养物。
CKC和DEF是初次分离血清Ⅰ型MDV的首选培养物，而CEF通常用于分离血清Ⅱ型和HVT病毒及致弱的血清Ⅰ型疫苗株。
培养物常用1×106～2×106个细胞剂量接种。
将分离获得的淋巴细胞,接种次代鸡胚成纤维细胞（CEF）,37℃，5%CO2培养箱中培养3h后换液,继续培养,每日观察有无蚀斑出现。
5天后不见明显蚀斑,则继续传代培养。
1.6间接免疫荧光试验
1.出现明显蚀斑后，将已出斑的MDV细胞毒用-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:
4，V/V）固定液固定5min，空气干燥,之后置密封容器于-20℃下保存备用
2.取出玻片滴加抗马立克病毒gB特异性单克隆抗体BA4在37℃下反应1h,之后用PBS洗涤5遍:
。
3.取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的羊抗鼠二抗）在37℃下反应1h,之后用PBS洗涤5遍。
之后在荧光显微镜下观察结果。
1.7病理切片诊断
1.取小块病料置于液态固定剂进行固定，是固定液快速渗透
2.取固定好的肝脏心脏组织进行脱水透明，步骤是：
用70%酒精2h，80%酒精2h，90%酒精2h，100%酒精Ⅰ1h，100%酒精Ⅱ1h，二甲苯Ⅰ6min，二甲苯Ⅱ6min。
3.浸蜡2h，使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。
将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。
之后存于低温冰箱后制作切片，切好的片子在58℃温箱长时间烘片，HE常规染色后置显微镜下观察。
1.8PCR（聚合酶链式反应）
Meq基因是血清Ⅰ型马立克病致瘤相关基因，因此在PCR检测中常选择检测Meq基因，但针对此基因设计的检测引物较多，各种引物的特异性和敏感性不同，检测的最终结果会受到影响。
因此，我们根据马立克病Meq基因序列特点，设计出一对特异性和敏感性相对较好的引物，对本实验室采集的疑似马立克病病鸡样品进行PCR检测、序列测定及分析。
以下列体系为条件进行PCR扩增（25ul体系）：
10倍buffer2.5微升
dNTP2.0微升
上游引物1.0微升
下游引物1.0微升
模板（100微克/微升）2.0微升
Tag聚合酶0.5微升
DDW16微升
PCR扩增程序:
94℃预变性5min，按照94℃变性50s,55℃退火50s,72℃延伸55s进行30个循环，最后一个循环结束后72℃延伸10min。
每次扩增都已无DNA模板的体系作为阴性对照。
用每个引物的最佳反应条件对其进行PCR扩增，后用1%的琼脂糖凝胶电泳，再用DuRed核酸染料染色10分钟，最后用凝胶成像仪照胶，观察是否扩增出目的大小片段。
2.结果与讨论
2.1剖检结果
剖检可发现病鸡腺胃肿大出血（图1），胸腺出血（图2），肝脏肿瘤（图3），心脏肿瘤（图4）
图1腺胃肿大出血图2胸腺出血
图3.肝脏肿瘤图4心脏肿瘤
2.2琼脂扩散试验结果
在对采集的病鸡血清及羽囊进行琼脂扩散试验,37℃反应48h后观察结果显示,病鸡羽囊出现明显沉淀线，血清未出现沉淀线,由此初步判断病鸡为MDV感染。
2.3病毒分离
将从病鸡中分离的淋巴细胞接种次代CEF，在五天的观察中,没有发现明显蚀斑,之后盲传至第三代开始出现蚀斑,到第四代可见大量典型的MDV蚀斑（图5）,我们将该株病毒命名为AH1410;第四代病毒蚀斑。
图5：
MDV蚀斑图6：
荧光下的MDV蚀斑
2.4间接免疫荧光试验
用抗马立克病毒gB特异性单克隆抗体BA4进行间接免疫荧光试验,在荧光显微镜下可清晰地看到亮绿色的病毒蚀斑,证明所分离病毒为MDV（图6）。
2.5病理切片诊断
马立克病又称传染性肿瘤病。
染病鸡的外周神经、内脏器官、性腺、眼球红膜、肌肉及皮肤均可能发生淋巴细胞浸润和形成肿瘤病灶，最后由于受害器官功能障碍而死亡。
所以我们做了几张病鸡的组织切片图7图8
图7：
肝内血管周浸润大量MD特有肿瘤细胞
图8：
心肌间浸润大量MD特有的肿瘤细胞
2.6PCR检测:
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳,结果显示,从病毒感染的CEF基因组中扩增出了目的片段
图9：
电泳结果
由电泳结果（图9）可知，2号样品马立克氏病病毒致瘤基因（MEQ）阳性。
3.讨论
在此次病例中，MD在注射过MDV疫苗的鸡群中爆发很可能就是由于马立克病病毒毒株基因突变和毒性加强有关。
MD通常开始爆发于4-6周龄，母鸡一般在10-12周龄，本例中在110日龄时爆发，符合正常现象。
在现代中国，使用疫苗仍然是普遍有效的重要防疫方法。
养鸡场常使用HVT疫苗，HVT+SB-1双联苗和CVI988疫苗来预防马立克病，HVT疫苗和HVT+SB-1双联苗易于贮存，而CVI988疫苗因为要在液氮中保存，很多养殖场不具备这个条件，所以相对使用较少，这也就导致了感染马立克病的风险[12]。
同时现在由于我国的养殖业的蓬勃发展，我们使用越来越多的疫苗，或者为了产生更强的免疫保护而加高疫苗的使用剂量，这也使马立克病病毒
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