工作报告之对流免疫电泳实验报告Word下载.docx
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沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小，分子结构、扩散系数和浓度等因素。
当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。
依据沉淀线（弧）可以定性抗原，诊断疾病。
此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。
操作方法
（一）制备离子琼脂板
用10ml量筒，量取4ml融化的巴比妥离子琼脂，倒在玻璃片上，待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。
图2的位置
打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧。
（二）稀释抗原和抗体
采用2倍连续稀释法。
将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23?
方式连续稀释。
方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）一份，在于第一管中加入抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出一份加入第二管中,如此依次稀释到最后一管。
其稀释倍数依次是：
2，4，8?
。
（三）加样
将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。
加样后置大培养皿内（皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度）。
盖好皿盖，于24—37℃温箱内保温24—48小时。
扩散后可出现清晰的沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效价。
（四）染色及保存
经染色后可提高沉淀线的可见度。
1.漂洗琼脂板：
将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐水2次以洗去未结合的抗原或抗体。
生理盐水浸泡后，更换蒸馏水浸泡1天，换水2次以除去盐分。
琼脂板较脆易破，操作需小心。
2.干燥：
取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。
3.染色：
将琼脂板置于染色剂（0.05%氨基黑10b）中浸泡，约5分钟（*注意观察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜色为度。
脱色后滴加少量5%的甘油至琼脂板上，置室温干燥保存。
如欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色剂、脱色剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。
本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉淀线的观测、且重复性差，必须做净化处理后方可使用。
琼脂凝胶和玻璃片结合不紧密，样品可从样品孔下泄漏；
在观察、漂洗时凝胶易于脱落。
为防止上述现象，可将玻璃板进行处理，方法是用0.1%~0.2%琼脂均匀
涂布在玻璃板上，自然干燥后再进行双向扩散实验。
在抗原、抗体单一体系中，抗原浓度不同，沉淀线特征不同。
如图3所示
图3的位置
抗原与抗体之间相对浓度不同，出现的沉淀线特征亦不同，如图4所示
在抗原、抗体多种体系中，抗原与相应抗体出现的沉淀线有多条，彼此互部干扰，如图5所示
图4
图5
试剂和器材
1.1.5%离子琼脂
（1）琼脂的净化：
高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则需要净化处理。
取30克优质琼脂加970mlh2o，加热至琼脂全部融化，即成3%的琼脂。
用
三、四层纱布热过滤，滤液流入一个搪瓷盘内，凝固后，切成1cm见方的小块，放在大容器中，将自来水同到容器底部，流水冲洗3天。
冲洗时于容器上捆好一层纱布，以防琼脂块顺水冲走。
然后用蒸馏水浸泡2~3天，每天换水2~3次。
琼脂块净化后即浸没于蒸馏水中，加万分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。
（2）巴比妥离子琼脂的制备：
离子强度0.06，ph8.6缓冲液：
称取10.3g巴比妥
取净化的3%的琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度0.06，ph8.6的巴比妥缓冲液，加热混匀，即成为离子强度0.03，ph8.6，1.5%巴比妥离
子琼脂。
在制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞防腐。
琼脂中的缓冲液，其离子强度最好比电极槽中的低1/2，这样可以避免在电泳时因电流过大引起琼脂变形（凸凹不平）。
2.
3.
4.
器材
1.
5.
6.
微量免疫电泳
免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测方法（双向扩散）结合起来的检测方法。
它提高了分辨率和灵敏度，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。
微量免疫电泳所用的样品和抗血清较少，而且测定时间短，灵敏度高，因此应用比较广泛。
在倒有离子琼脂的饿玻璃片的中心挖一长槽，槽的两侧个挖一个圆孔，孔内加入待测样品，如图6a所示。
电泳时，样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性质各异，因而
被分离成几个区带（如图6b所示）。
电泳后在中央槽中加入相应抗血
清，置37℃扩散。
被分离的蛋白质与相应抗体形成大小不同、深浅各
异的沉淀弧（如图6c、d所示）。
一般情况下，每一沉淀弧即代表蛋
白质混合液中的一种成分，以此定性或半定量。
图6
（一）制备离子琼脂板
将前述实验的离子琼脂加热融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后按图7所示打孔和打槽，用注射器针头将孔内琼脂挑出。
槽内琼脂在电泳分离以后在挑出，以免电泳时横槽变形影响双向扩散。
图7
（二）电泳
于两个电泳槽中防入离子强度为0.06，ph8.6的巴比妥缓冲液。
将琼脂板平置于两个电极槽之间，为使电路连通，于缓冲液的液面到琼脂板之间，用单层滤纸或纱布搭桥形成通路，接通电源加10v电压，用小滴管取样品注入琼脂板孔内，假样量与孔平或稍少，调电压至100~150v，通电40~60分钟，当血清中色素泳动到距边缘约1.5cm时，断电，取出琼脂板，用注射器针头将横槽中的琼脂挑出，加抗血清，水平置于湿盒（或培养皿中），于37或24进行双向扩散24-48小时后，取出观察实验结果。
（三）染色
参看双向免疫扩散法实验。
在免疫电泳实验中的琼脂电泳分离法，可用其他蛋白电泳技术代替，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳法等。
电泳后切下相应的胶带置于玻璃板上，倒上离子琼脂。
当凝胶与胶带紧密帖在一起并凝固后，在距胶带约0.5cm处打横槽，挑出琼脂，加抗血清进行双向扩散。
由于不同电泳方法对蛋白质抗原的浓度要求不同，要根据抗原、抗体沉淀反应的合适比例稀释抗血清。
沉淀弧的曲度大，说明该种蛋白质的含量较高，电泳时扩散也较为严重之故。
曲度对称说明蛋白质分子均一，不对称似直线或直线上有小弧，说明蛋白质分子不均一。
电泳时一般稳压在100~150v范围，电流可用凝胶板两侧滤纸桥
的层数加以调节，一般一层滤纸即可，电流过大致使凝胶发热，水分蒸发快，影响电泳效果。
凝胶中缓冲液浓度为电极缓冲液的一半，这样可减少电流的作用，也可增加蛋白质的泳动速度。
要根据样品鉴定的不同要求，选择抗血清。
检测蛋白质混合液（如血清或组织粗提液）中所需成分的存在及多寡，需用纯样品制备的抗血清和用混合液制备的抗血清对照检测，如图8。
【篇二：
免疫实验考试复习】
实验复习题
一、选择题：
1.夹心elisa法检测hbsag时，用于包被固相载体的物质是：
c
a.纯化的hbsagb.酶标记的hbsagc.纯化的hbsab
d.酶标记的hbsabe.辣根过氧化物酶
2.间接elisa法检测hbsab时，用于包被固相载体的物质是：
a
3.血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗a抗体混合发生凝集，与抗b抗体混合未发生凝集，则待检血的血型是：
a.a型b.b型c.ab型年d.o型e.不能确定
4.血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗a抗体混合不发生凝集，与抗b抗体混合发生凝集，则待检血的血型是：
b
5.不属于人工主动免疫制剂的是（c）
a.乙肝疫苗b.白喉类毒素c.破伤风抗毒素d.百日咳疫苗e.脊髓灰质炎疫苗
6.不属于人工被动免疫制剂的是（e）
a.破伤风抗毒素b.血浆免疫球蛋白c.胎盘免疫球蛋白
d.静脉注射用免疫球蛋白e.白喉类毒素
二、填空：
对流免疫电泳实验，电泳时抗原端接阴极，抗体端接阳极。
三、名词解释
1.沉淀反应（precipitationreaction）
毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物。
2.凝集反应（agglutinationreaction）
细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。
3.免疫标记技术（immunolabelingtechniques）
是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。
4.人工主动免疫（artificialactiveimmunization）
用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防干扰的措施。
5.人工被动免疫（artificialpassiveimmunization）
是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染的
措施。
四、问答题
1.简述e-花环试验的基本原理。
人Ｔ细胞膜上具有能与绵羊红细胞（srbc）上lfa-3（淋巴细胞功能相关抗原－3）结合的受体（Ｅ受体，即cd2分子）。
srbc与Ｔ细胞在含有血清的平衡盐水中结合，形成以Ｔ细胞为中心，四周环绕srbc，状如环瑰花环细胞集团，故称Ｅ花环试验。
2.简述cdc试验的基本原理。
细胞表面抗原与相应抗体特异结合所形成的免疫复合物，通过经典途径激活补体而导致细胞膜穿孔。
因此水溶性染料如台盼蓝进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反应；
不带相应抗原的细胞。
未受伤，不染色，为阴性反应。
3.简述elisa的基本原理。
先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；
加入待检标本，充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；
加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；
加底物后，酶分解底物后产生呈色反应。
【篇三：
常见免疫学试验技术】
免疫学实验
实验一与免疫相关的细胞形态的观察
目的要求：
观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。
实验器材：
显微镜
血液涂片（瑞氏染色）
结缔组织切片
方法：
油镜观察
一．血涂片的观察
（a）红细胞：
淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（b）颗粒白血球
嗜中性颗粒白血球：
体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。
直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：
略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。
直径10—15微米。
嗜碱性颗粒白血球：
体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。
直径10—11微米。
1
（c）无颗粒白血球
淋巴细胞：
涂片中可观察到中、小型两种。
小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。
其中含致密的核，染成深紫色。
周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。
中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。
6-8微米。
单核细胞：
体积最大，细胞圆形。
胞质染成灰蓝色。
核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
直径14-20微米。
二．肥大细胞的观察（示教）
胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。
其中含肝素、组织胺等物质。
常成群地分布于血管的周围。
三．浆细胞的观察（示教）
细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。
核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。
正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。
浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：
又称组织细胞，细胞形态不规则。
常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。
附：
瑞特氏染色：
1．染色液配置
称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。
贮褐色瓶中备用。
（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。
）
2．瑞特氏染色法：
取小鼠骨动脉血，涂制玻片。
干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限制染液流掉）。
于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。
经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。
2
实验二沉淀反应
可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（precipitation）.由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。
沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。
为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。
沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。
此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。
（一）环状沉淀反应
当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。
材料：
3.免疫血清：
免疫兔抗人血清抗原：
人血清小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。
1.取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。
3.以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。
用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。
性。
置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳
3
（二）.琼脂扩散试验
琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。
这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。
琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试验。
（1）
1．诊断血清（抗体：
抗人igg或iga免疫血清）
2．待检血清（抗原）：
人血清
3．参考血清：
全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。
4．其它：
生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。
1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。
单向琼脂扩散试验
图1单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图
1-5孔加参考血清，6-7孔加待检血清
4
3．向孔内滴加1：
2，1：
4，1：
8，1：
16，1：
32稀释的参考血清及1：
10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。
4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。
5．测定各孔形成的沉淀环直径（mm）,用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。
（2）
1．诊断血清：
兔抗人血清
2．待测血清：
3．阴性对照血清
生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。
孔的排列方式如图2所示。
双向琼脂扩散试验
图2双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
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