生物腐殖酸高产菌株筛选详解Word格式文档下载.docx
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一方面，其本身就可以促进作物呼吸和新陈代谢、促进各种酶特别是糖转化酶的活性、促进细胞发育和植物生长、增强植物吸收养分能力等，从而提高作物的产量。
另一方面，腐植酸对化肥和微肥有明显的增效作用，它能与化学肥料复配成有机—无机复合肥，增加肥效，减少化肥被固定和流失，提高化肥的利用率；
同时，腐植酸结构单元上含有羧基、羟基、醇羟基、醌基、半醌基、甲氧基、烯醇基、胺基等多种活性功能团，作为一种源广价廉的天然螯合剂，腐植酸与土壤中难溶于水的微量元素等螯合后使得微量元素很容易被作物吸收和运转。
自然界腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及煤炭中。
我国是腐植酸资源大国，其资源储量大，分布广，品位好[1，2,3]。
近年来，我国也通过秸杆发酵生产人工合成腐植酸类物质的生化腐植酸[4]。
腐植酸类物质的基本性质和特征决定了它在保持农业生态系统健康中有着重要的应用意义，因而也越来越引起人们的重视[5]。
1.2腐植酸的形成
关于腐植酸形成的微生物学机理在20世纪主要有七种影响着我国学术界。
一是瓦克斯曼提出的木质素----蛋白质复合体学说；
二是威廉斯提出的微生物作用学说；
三是微生物合成假说；
四是植物和微生物细胞自溶假说；
五是科诺诺娃学说；
六是恩德斯提出的植物残体形成腐植酸的过程和煤化机制；
七是我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论,即水解阶段—产酸阶段—合成和聚合阶段。
指出参与厌氧发酵形成腐植酸的微生物不是一个纯菌种,而是由多个微生物生理群联合作用的结果。
在此对我国学者边文骅提出的厌氧发酵形成腐植酸的三个基本阶段理论进行阐述。
边文骅学者从自然界选取优质活性污泥为菌种，在室内富集培养扩大，优化生产条件，在500mL、5000mL发酵器发酵试验的基础上，扩大为1m3、20m3环流厌氧发酵器的中试生产规模均获得了良好的效果。
从而认识到，腐植酸是有机物质（动、植物残体）在适当的温度、湿度、酸碱度和厌氧条件下，通过功能不同的多种微生物的代谢，形成腐植酸的过程，这一过程大概分为三个阶段。
第一阶段，或称水解阶段，由发酵细菌产生胞外酶水解大分子有机物质如纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶质、脂肪和蛋白质等。
根据他们作用的底物不同，分别称为纤维素分解菌、半纤维素分解菌、木质素分解菌、淀粉分解菌、脂肪分解菌和蛋白质分解菌等生理群，在它们的作用下，多糖类物质水解为单糖，蛋白质水解为肽和氨基酸，脂肪水解成甘油和脂肪酸。
第二阶段，或称产酸阶段，进入细胞的各种可溶性物质，在各种胞内酶的作用下进一步分解代谢，生成多重挥发性脂肪酸和醇,如乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇、乙醇等，同时出现许多活性基团，如-OH、-COOH等。
第三阶段，或称为合成和聚合阶段，在微生物细胞内合成，菌体死亡后释放出来或在细胞外通过聚合作用生成腐植酸[6]。
1.3腐植酸分类
腐植酸分类因其形成与来源方式而不同。
按照腐植酸的形成方式分为两大类：
天然腐植酸和人工腐植酸。
前者包括土壤腐植酸、水体腐植酸和人工腐植酸；
后者包括生物发酵腐植酸、化学合成腐植酸和氧化再生腐植酸。
按照腐植酸来源的方式分为三大类：
原生腐植酸、再生腐植酸与合成腐植酸。
原生腐植酸是天然物质的化学组成中所固有的腐植酸。
再生腐植酸是指各阶段煤经过自然风化或人工氧化方法生成的腐植酸。
合成腐植酸通常系指用人工方法从非煤类物质所制得的与天然腐植酸相类似的物质[7]。
1.4腐植酸的提取
腐植质是一类广泛存在于自然界的天然高分子有机物。
它具有比表面积大、结构复杂、带有多种活性官能团，能够与许多有机、无机物发生相互作用。
在工农业、医药、环保等领域有广泛的用途。
腐植质的主体是腐植酸与金属离子相结合的盐类，要想得到腐植酸，就必须将其从土壤或溶液中提取出来，但较为困难，腐植质根据其溶解性质可以分为3个级分：
富里酸（既溶于酸又溶于碱），腐植酸（只溶于碱而不溶于酸），胡敏素（不溶于酸和碱）。
思路是：
先将土壤或溶液中未分解或部分分解的动植物残体分离，然后用不同的溶剂来浸提土壤或溶液，最终得到腐植酸。
腐植酸的提取方法主要有三种：
酸抽提法、碱抽提法和微生物溶解法。
酸抽提法首先在原料中加入稀酸混匀，进行蒸汽煮沸并搅拌，后进行过滤或离心，取上清液水洗至pH=5后收集沉淀物即得到腐植酸[8]。
碱抽提法与酸抽提法操作相似，首先加入碱抽提剂（氢氧化钠或碳酸钠），使原料中的腐植酸生成水溶性的腐植酸钠，将其与原料进行分离，将得到的腐植酸钠溶液进行酸化，生成腐植酸析出。
可在碱抽提前进行空气氧化预处理、硝酸氧化预处理或超声波预处理，以提高腐植酸的提取率[9]。
微生物溶解法先将培养基分装，灭菌后接入特定的微生物，生长一段时间后加入一定量的腐植酸灭菌样品，然后置于培养箱或摇床中，使菌、胞外液、培养液与腐植酸接触并发生作用。
待溶解的腐植酸使培养液染成较深的颜色后，测定一定加样天数里腐植酸的转化率。
方法是将培养液与菌和未转化的腐植酸分离，得到溶液用硫酸使转化为腐植酸沉淀下来[10]。
三种方法各有各的优缺点，酸抽提法比较早的操作坊法，简单，易于操作，生产周期短，而且省去碱法使用的碳酸物，因此酸抽提法价格比较低，但是酸抽提剂法后的腐植酸因含杂质太多,使其应用受到限制。
碱抽提法是目前主要使用的方法，操作同样简单，周期短，只是使用得碱抽提剂的价格比较贵。
微生物溶解法是新兴的方法，其反应温和，可清洁转化，产物生物活性高，缺点是反应周期长，产率低，现主要作为实验研究。
1.5腐植酸的性质
1.5.1溶解性
腐植酸能或多或少地溶解在酸、碱、盐、水和一些有机溶剂中，因而可用这些物质作为腐植酸的抽提剂。
这些抽提剂一般分为碱性物质（如KON、NH4OH、Na2CO3、Na4P2O7等）、中性盐（如NaF、Na2C2O3等）、弱酸性物质（如草酸、柠檬酸、苯甲酸等）、有机溶剂（如乙醇、酮类、吡啶等）和混合溶液（NaOH和Na4P2O7混合）五类[11]。
1.5.2胶体性质
腐植酸是一种亲水胶体，低浓度时是真溶液，没有粘度；
而在高浓度时则是一种胶体溶液或称分散体系，呈现胶体性质。
当加入酸类或高浓度的盐类物质时可使产生凝聚，一般使用稀盐酸或稀硫酸，保持溶液pH在3～4之间时，此溶液经静止后就能很快析出絮状沉淀[12]。
1.5.3酸性
腐植酸分子结构中有羧基和酚羟基等基团，使其具有弱酸性。
所以腐植酸可以与碳酸盐、醋酸盐等进行定量反应。
腐植酸与其盐类组成的缓冲哦、溶液，可以调节土壤的酸碱度，使农作物在适宜的pH值条件下生长。
1.5.4离子交换性
腐植酸分子上的一些官能团，如羧基-COOH上的H+可以被Na+、K+、NH4+等金属离子置换出来而生成弱酸盐，所以具有较高的离子交换容量。
腐植酸的离子交换容量与pH有关，当pH从4.5提高到8.1时，腐植酸的离子交换容量从1.7mol/g增加到5.9mol/g。
1.5.5络合性能
由于腐植酸含有大量的官能团，可以与一些金属离子（Al3+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Cr3+等）形成络合物或螯合物。
腐植酸结构中参与金属漯河或螯合的官能团一般是羧基和酚羟基，可能还有羰基和胺基。
1.5.6生理活性
腐植酸的生理活性系指腐植酸促进生物体生理活动的能力。
腐植酸的生理活性在植物上表现为刺激植物生长代谢、改善子实质量和增强植物抗逆能力，但与腐植酸的浓度和腐植酸的分子量大小有关系[13]。
1.6本课题选题依据
1）目前为止，我国生物腐植酸行业还处于初级阶段，生物腐植酸发酵厂采用的发酵方法主要是人工堆建发酵法，产量低、产品质量不稳定，某些生产环节（如干燥）仍依赖于自然条件，通过酸碱反应提取腐植酸液，提取率低，而且生产的生化腐植酸农用产品中含有益菌数量较低；
2）福建省诏安县绿洲生化有限公司采用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和自然菌群复合发酵甘蔗渣制取生物腐植酸，不但含量较高，而且产品中保留了大量有益菌，使产品功能更趋丰富。
但目前该公司还处于中试生产规模，现有菌种的蔗渣转化和产酸能力还有待进一步提高，发酵和干燥等生产工艺还有待进一步改进。
3）中国腐植酸工业协会和专家学者多次提倡生物腐植酸行业应规模化、机械化，应以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产。
1.7研究内容与创新点
1.7.1研究内容
1）菌种分离
以纤维素筛选培养基为基础，从不同蔗渣原料及腐植酸产品中分离筛选耐高温的纤维素降解菌，主要分离纯化细菌和霉菌，并获得单一菌株。
2）菌种初筛
以工厂发酵生产腐植酸模式为条件，研究各单一菌株产腐植酸的性能，以活性腐植酸产量为指标，筛选能高效生产腐植酸的菌株。
1.7.2创新点
本课题从现有发酵原料和发酵产品中分离能高效分解蔗渣并转化成活性腐植酸的菌株，并对初筛的菌株进行单一发酵和组合发酵生产腐植酸进行研究，这为后续以定向菌种提升产品功能，实现生物腐植酸的产业化生产奠定良好基础。
第二章实验材料与方法
2.1主要器材
2.1.1材料
发酵原料与产品来源：
由诏安绿洲生化有限公司提供。
2.1.2培养基
2.1.2.1细菌、霉菌的分离培养基
1）细菌分离培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，琼脂15-20g，工厂生活用水1000mL，
pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。
（注：
液体培养基不加琼脂，其他成分一样，装100mL）
2）霉菌分离培养基：
察氏培养基
NaNO32g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，蔗糖30g，
琼脂15～20g，工厂生活用水1000mL，pH自然，121℃蒸汽灭菌20min。
2.1.2.2纤维素降解菌筛选培养基
（NH4）2SO42g，KH2PO41g，MgSO4·
7H2O0.05g，NaCl1g，琼脂20g，
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15～20g，工厂生活用水1000mL，pH7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。
液体培养基不加琼脂，其他成分一样,装100mL）
2.1.2.3蔗渣发酵培养基
尿素0.632%，NaCl0.0126%，KH2PO40.126%，MgSO40.0632%，CaCO30.632%，花生饼粉1.58%，花生油1.58%，麸皮31.58%，蔗渣63.16%,工厂生活用水60～65%，121℃蒸汽灭菌20min。
2.1.3主要试剂
（1/6）0.1mol/L重铬酸钾标准溶液：
重铬酸钾120℃烘干约2小时烘干至衡重后准确称取4.9g，工厂生活用水溶解，定容至1000mL。
（1/6）0.8mol/L重铬酸钾标准溶液：
重铬酸钾120℃烘干约2小时至衡重后准确称取39.2g，工厂生活用水溶解，定容至1000mL。
邻菲罗啉指示剂：
称取邻菲罗啉1.485g，硫酸亚铁铵0.695g，溶于100mL工厂生活用水中。
硫酸亚铁铵标准溶液：
称取硫酸亚铁铵40.00g加工厂生活用水700mL溶于1000mL容量瓶中，溶毕加入20mL浓硫酸，冷却后加水定容至1000mL，用前标定：
准确吸取（1/6）0.1mol/L重铬酸钾标准溶液20mL于250mL锥形瓶中，加工厂生活用水80mL和浓硫酸10mL，冷却后滴加邻菲罗啉指示剂4滴，用硫酸亚铁铵滴定至溶液从红色转为砖红色为滴定终点。
2.1.4主要仪器
表2-1主要实验仪器
仪器名称
仪器型号
生产厂家
超净工作台
SP-DJ型
上海浦东物理光学仪器厂
恒温水浴锅
DK－S24型
上海精宏实验设备有限公司
电子天平
BL150型
北京赛多利斯仪器系统有限公司
灭菌锅
YXQ-SG41-280型
上海医用核子仪器厂
干燥箱
101-2型
上海市实验仪器厂
生化培养箱
LRH-190型
广东省医疗器械厂
光学显微镜
XS18
上海光学仪器厂
微型漩涡混合器
H-1
上海精科实业有限公司
样品粉碎机
DZ1-02
上海淀酒食物机械制造有限公司
调速摇床
HY-8
常州国华电器有限公司
其它：
90mm培养皿、烧杯（1000mL、500mL、250mL、100mL）、三角瓶（300mL）、容量瓶（100mL、250mL、1000mL）、移液枪（1mL、5mL）、玻棒、滴定管、酒精灯、接种环、试管、漏斗、定性滤纸、过滤网（1mm）、电炉（600W）等。
2.2实验方法
2.2.1蔗渣原料微生物的分离纯化
各取10g的蔗渣原料3份，做三个试验组。
其中一组的物料不做任何处理，其余两份分别进行60℃下烘30min，以及添加50mg的多粘菌素B。
将三种不同处理方式下的物料放入盛有100mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇10～20min后，吸取1mL液体于盛有9mL无菌水的大试管中，进行梯度稀释；
取适宜稀释度的液体分别涂布于细菌培养基和霉菌培养基平板。
细菌培养基倒置于37℃恒温箱中培养1～2天，霉菌培养基倒置于30℃恒温箱中培养3～4天。
挑取各培养基平板上形态特征不同的单菌落，进一步分离纯化，将纯种转接斜面培养后保存于4℃冰箱中。
2.2.2耐高温纤维素降解菌的筛选
将初步分离出的各类单一菌株接入牛肉膏平板或察氏培养基上，均置于45℃下培养，比较不同菌的生长情况。
后将能在45℃下良好生长的菌株接种到纤维素培养基上，最终筛选出能在45℃下生长并能降解纤维素的菌株。
2.2.3发酵菌株的优化
2.2.3.1腐植酸高产菌株的初筛
将上述筛选到在45℃下生长并能降解纤维素的菌株分别接入相应的液体培养基中进行活化，其中细菌置于200r/min、30℃下培养约36h，霉菌置于200r/min、30℃下培养2～3d。
将活化后的各单一菌株以10%的接种量接入到蔗渣发酵培养基中进行发酵，发酵周期一般为6～7d。
实验测定发酵初期以及发酵后产品中的腐植酸含量，以腐植酸含量为指标，取腐植酸含量增加最多的为优势菌株。
其中，对照组测定为工厂拌料并加入工厂发酵用的菌液，简称“加工厂菌”；
实验组为两组：
一组为发酵培养基在未加入工厂菌液的情况下搅拌均匀后接入筛选的单一测试菌株；
另一组是将发酵培养基灭菌后再以无菌方式接入待发酵菌株。
而腐植酸初始值的测定均以未接入发酵菌种前测得。
2.2.3.2腐植酸高产菌株的初筛
分别将初筛出的高产腐植酸细菌或者霉菌进行两两组合或多种组合后接入发酵培养基中进行发酵，总的接种量均为10%，其中两两组合的接种比例为1：
1，多种组合则为：
1：
1，发酵周期为6d。
以腐植酸增长量为指标，筛选出产腐植酸含量高的菌株配伍。
2.2.4腐植酸含量测定
发酵样品（发酵前物料、发酵后物料）的烘干有三种方式。
一种为放置在60℃恒温箱中烘2h左右；
第二种为放置在红外灯下烘4～6h；
第三种是将物料放在室外天然晾干。
实验证明三种处理方式对物料的腐植酸含量变化影响不大。
将烘干后的物料用样品粉碎机粉碎，并用1mm过滤网过滤。
精确称取过滤后发酵样品0.5000g，加蒸馏水80mL于250mL容量瓶中，沸水浴30min，以蒸馏水定容至刻度，过滤。
精确移取5mL清液、2mL（1/6）0.8mol/L重铬酸钾标准溶液、10mL浓硫酸于250mL锥形瓶中，沸水浴氧化30min，取出冷却后加水约70mL，再加入邻菲罗啉指示剂四滴，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液从橙色转为砖红色为终点；
每个样品重复二次。
同样条件下做空白实验，取5mL自来水取代5mL样品液。
（V0-V1）×
c×
0.003
腐植酸含量%=×
100%
m×
5/250×
0.5
式中：
V0——滴定空白消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL；
V1——滴定样品消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积，mL；
c——硫酸亚铁铵标准液浓度，mol/L；
m——样品取样质量，g；
0.003——1ml的0.1mol/L硫酸亚铁铵相当的碳的质量，g；
0.5——腐植酸含碳率。
第三章结果与讨论
3.1不同处理方式的蔗渣原料微生物的分离纯化
本次实验经过多次平板分离纯化，共在牛肉膏细菌平板上分离到25株菌，在霉菌平板上分离到6株菌。
按照原料处理方式离菌种，结果见表3-1
表3-1不同处理方式分离出的菌株数量及标号
6号，7号，8号，9号，18号，19号，20号，A号,B号,C号,D号,E号。
共12株菌
4号，5号，15号，21号，22号，23号，24号，A号,B号,C号,D号,E号。
1号，2号，3号，10号，11号，12号，13号，14号，16号，17号，25号，A号,B号,C号,D号,E号。
共16株菌
注：
：
未进行任何处理；
60℃下烘30min；
添加多粘菌素（抗生素）
3.2实验菌株的筛选
3.2.1耐高温且利用纤维素菌株的筛选
对在细菌平板上分离的25株菌和霉菌平板上分离的6株菌进行在纤维素平板培养，并在45℃下放置培养。
其中细菌培养2d左右，霉菌培养3到4d。
结果见表3-2。
表3-2耐高温且利用纤维素菌株的筛选
菌种
生长周期（h）
45℃下生长
利用纤维素
1号
24
++
2号
40
+
―
3号
4号
5号
6号
7号
8号
9号
48
10号
11号
续表3-2
12号
13号
14号
15号
16号
18
17号
18号
19号
20号
21号
22号
23号
24号
25号
A号
96
B号
C号
D号
E号
“＋＋”生长或利用较快；
“＋”表示有生长或有利用；
“―”表示不生长或不利用。
最终筛出细菌1号菌，3号菌，12号菌，13号菌，15号菌，19号菌，25号菌。
霉菌A号菌，B号菌，C号菌，D号菌，E号菌。
3.2.2菌株的形态观察
对上述初步分离得到的12株单一菌株进行个体形态和菌落形态的观察，结果见表3-3。
由于其中B号菌，C号菌，D号菌，E号菌在霉菌平板上生长菌落与个体形态均不具备霉菌特征，且其在细菌平板上均能够生长，故将B号菌,C号菌，D号菌，E号菌四株菌划归为细菌。
所以经过试验得出能够利用纤维素培养基的菌株是：
细菌11株，霉菌1株。
表3-3初步分离的各菌株的菌落、个体特征
菌落形态特征
个体形态特征
中等、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘整齐
短杆状，有大量芽孢，染色深
续表3-3
中等、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘不整齐
短杆（相当短）状，大量芽孢，染色深
大、灰白、干燥、圆形、下凹、不透明、边缘整齐
短杆状，有大量芽孢
细小，短杆状，一头尖，有大量芽孢
小、灰白、湿润、圆形、扁平、不透明、边缘整齐
短小芽孢杆菌，染色深
中等、灰白、干燥、圆形、扁平、不透明、边缘整齐，中间有褶皱
杆状，有芽孢
小、灰白、湿润、不规则、扁平、透明、边缘整齐
短杆状，无芽孢
菌丝为较为紧密的絮状，孢子色为灰黄色，菌落与培养基接合较为紧密，不易挑起
可见分生孢子头疏松放射状
中等、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐
杆状，有大量芽孢，染色深，菌体较小
中等、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐，中间有褶皱
杆状，有大量芽孢，染色深，菌体大
大、灰白、湿润、圆形、凸起、不透明、边缘整齐
杆状，少量芽孢，染色深，菌体较大
3.3测定单一菌种发酵的腐植酸含量
本次发酵实验在工厂实地进行，其中发酵培养基由诏安绿洲生化有限公司车间拌料机混合统一拌料。
将活化好的各单一菌种按10%的接种量加入到装有80g湿物料的300mL三角瓶中，并用微型漩涡混合器使菌液和物料混合均匀。
其中，每次单一菌株发酵试验均为两个实验组，一组为发酵培养基经过灭菌后接种，另一组则为发酵培养基不经过灭菌。
同时以原先工厂菌进行发酵为对照组，即将加入工厂自制菌种拌料均匀后准备装袋发酵的物料取出称取80g放入300ml三角瓶中，与其他实验组三角瓶一起放入车间发酵池中进行发酵。
发酵三角瓶放置在一层物料之下，尽量放置在最适合实验菌种发酵的位置，同时兼顾取物料的方便。
一般物料在车间发酵池中放置6d或者7d即取出。
物料发酵后同时随机取取工厂袋装物料一份，取出位置为最上层麻袋。
本轮试验的菌种包括本人在校实验室分离的11株细菌和1株霉菌，还有诏安绿洲生化有限公司自行保存的两株菌：
枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌，共计14株。
本人对这14株菌进行了两轮试验，试验条件以尽量接近工厂实际生产为准。
本次实验对实验组分别采用培养基灭菌与不灭菌的处理，其中，
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