以pPIC9K为例的酵母表达纯化Word格式文档下载.docx
《以pPIC9K为例的酵母表达纯化Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以pPIC9K为例的酵母表达纯化Word格式文档下载.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
蛋白有一部分被降解了。
四、附:
信号肽切割原理和优化切割
《ExpressionofYourRecombinantProteinwithaNativeN-terminus》
IfyouwishtohaveyourproteinexpressedwithanativeN-terminus,youshouldclone
yourgeneflush（直接地）withtheKex2cleavagesite.UsePCRtorebuildthesequencefromtheXhoIsiteatbp1184-1189totheargininecodonatnucleotides1193-1195.Remembertoincludethefirstaminoacidofyourprotein,ifnecessary,forcorrectfusiontotheKex2cleavagesite.
SignalSequenceProcessing
Theprocessingoftheα-factorsignalsequenceinpPICZα
occursintwosteps:
1.ThepreliminarycleavageofthesignalsequencebytheKEX2geneproduct,
finalKex2cleavageoccurringbetweenarginineandglutamineinthesequence
Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala,where*isthesiteofcleavage.2.TheGlu-AlarepeatsarefurthercleavedbytheSTE13geneproduct.
OptimizationofSignalCleavage
InSaccharomycescerevisiae,ithasbeennotedthattheGlu-Alarepeatsarenotnecessary
forcleavagebyKex2,butcleavageafterGlu-Lys-Argmaybemoreefficientwhen
followedbyGlu-Alarepeats.AnumberofaminoacidsaretoleratedatsiteXinsteadof
GluinthesequenceGlu-Lys-Arg-X.Theseaminoacidsincludethearomaticaminoacids,
smallaminoacids,andhistidine.Proline,however,will
inhibitKex2cleavage.Formore
informationonKex2cleavage,pleasesee（Brakeetal.,1984）.
TherearesomecaseswhereSte13cleavageofGlu-Alarepeats
isnotefficient,andGlu-
AlarepeatsareleftontheN-terminusoftheexpressedprotein
ofinterest.Thisis
generallydependentontheproteinofinterest.continuedonnextpage
五、翻译Genebank所查序列
为设计一个引物，在Genebank上查找序列如下:
CDS序列是57,560，sig_peptide从57,119，mat_peptide从
120,557。
问题如下:
1、sig_peptide和mat_peptide各代表什么意思，sig_peptide是
不是就是信号肽，哪mat_peptide是什么,
2、sig_peptide前面1,57是序列的什么部分,
3、cDNA序列中除了CDS是编码区外其它部分主要起什么作用，在设
计引物时应该从第一个碱基开始还是从信号肽开始，还是从CDS的第
一个碱基开始～
答:
sig_peptide信号肽，mat_peptide成熟肽，就是切除信号肽以
后的成熟蛋白元件。
sig_peptide前面1,57是5‘非编码序列，它
一般含有Kozard序列，在翻译起始过程中发挥作用。
3’非编码序列
是帮助翻译的终止。
酵母转化原理:
LikeSaccharomycescerevisiae,linearDNAcangeneratestabletransformantsofPichia
pastorisviahomologousrecombinationbetweenthetransformingDNAandregionsof
homologywithinthegenome（Creggetal.,1985;
Creggetal.,1989）.Suchintegrants
showextremestabilityintheabsenceofselectivepressureevenwhenpresentasmultiplecopies.Notethatsinglecrossoverevents（insertions）aremuchmorelikelytohappenthandoublecrossoverevents（replacements）.Multipleinsertioneventsoccurspontaneouslyatabout1-10%ofthesingleinsertionevents.
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区
域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Creggetal.,
1985;
Creggetal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即
使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插
入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概
率的多插入事件.
电转化注意点:
一、制备感受态的菌液收集时间:
1、准确测定OD值:
OD在1.2,1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。
每个倍数做3,5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确～菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够～
2）OD值是否测准也可以这样估算:
OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2,1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50,100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌
液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ulEP管分装，-70或-80摄氏度保存。
另附:
酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5mlYPD液体培养基，30?
，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30?
培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4?
保存。
四、电转化注意点:
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀～（怕量不够，吸
得很多，电转时效果反而不好。
）
3、电转杯清洁处理:
一般先冲洗，洗净;
然后浸泡在75%的乙醇中;
使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。
电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。
电击条件比如1.5kv，放电4.8,5.5ms。
电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。
如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。
转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。
如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生
长。
2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。
3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70,乙醇洗一遍，约20ulddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一:
高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物（OD约6-10）分装到1.5mlEP管中，4?
、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水（4?
）洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
处理液:
10mMLiAc
10mMDTT
0.6Msorbitol
10mMTrisHCl（pH7.5）
3.离心，弃上清，加入1ml1Msorbitol，离心，弃上清，4.用1Msorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过Bgl?
酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.
6.电转.1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL1Msorbitol，吸出后于30?
培养2h。
8.取一定量涂平板（YPDS+Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上）
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
方法二:
按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;
小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下:
1、目的DNA（pPIC9K），经电泳检测已经线性化（SalI酶切）;
2、DNA纯化方法是经酚仿,氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够;
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1:
100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3
左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴;
5、菌液离心5min,100ml冰水洗涤,50ml冰水洗涤,4mlsorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital;
6、加入约5,10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min;
7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。
9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）:
1、菌液收集时间:
以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。
1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。
菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够～你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3,5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确～
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50mlYPD中，培养大概18个小时吧。
OD值是否测准可以这样估算:
[测OD，用什么作空白对照呢,菌体稀释液，我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8,5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，
不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀～（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。
如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。
42度水浴一会，然后过滤除菌。
我没有加硫酸铵。
YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。
方法三:
简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别（成功做出几个基因）:
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
方法四:
没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，
然后高压灭菌）
1.挑取酵母单菌落，接种至含有50mlYPD培养基的三角瓶中，30?
、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min,50ml冰水洗涤,25ml冰水洗涤,2mlsorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital;
两管分装，每管100ul3.加入约5,10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min;
4.电击，1,5KV.使用的是Eppendorf2510，用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µ
l涂布一块平板;
方法五:
和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100mlYPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
（1）1500,1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清
（2）加入100ml冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3,5分钟
（3）离心，弃上清，再加100mlddH2O洗一遍
（4）离心，弃上清，加20ml冰浴1MSorbitol洗一遍（5）离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100,200ulSorbitol
混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul
黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400,500ul，够做几管感受态了。
（7）吸取100,150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数:
1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
（9）立即加入1mlSorbitol，转入10ml离心管，30度静置1小时，然后加入1mlYPD，30度，200rpm摇1小时，取50,200ul菌液涂100ul/mlYPDS板
（10）一般转化效率可以达到:
200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。
方法六:
酵母感受态细胞的制备
?
接种PichiapastorisGS115于5mlYPD液体培养基，30?
，250~300250rpm，过夜。
取200µ
l的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30?
、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。
?
将细胞培养物于4?
，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀
重悬;
按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml;
NOTE:
可将其分装为200µ
l一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。
化学转化
毕氏酵母氯化锂转化法
试剂
1.1MLiCl:
用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌;
必要时用消毒去离子水稀释
2.50%PEG3350:
SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装
3.2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20?
保存
注:
醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效;
PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
毕氏酵母的转化
1.煮沸1ml鲑鱼精DNA5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA;
2.将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液;
3.对于每一个转化，按以下顺序加入:
50%PEG3350240ul
1MLiCl36ul
2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul5,10ug/50ulH2O质粒DNA50ul
4.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）;
5.30?
水浴孵育30min;
6.42?
水浴热休克20,25min;
7.6000,8000rpm离心收集酵母菌体;
8.重悬酵母于1mlYPD培养基，30?
摇床孵育;
9.1,4h后，取25,100ul菌液铺选择性培养基平板，于30?
培养2,3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30'
c培养至转化子出现）
毕氏酵母PEG1000转化法
缓冲液A:
1.0MSorbitol，10mMBicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethyleneglycol
缓冲液B:
40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2MBicine，pH8.35缓冲液C:
0.15MNaCl，10mMBicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70?
1.缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20?
保存;
2.将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;
如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;
待转化毕氏酵母的制备
1.接种环接种Pachiapastoris于YPD平板，30?
培养2d;
2.挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30?
振荡培养过夜;
3.取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5,0.8;
4.室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次;
5.重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，6.-70?
保
升级会员 