使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术Word下载.docx
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注意：
以下举例多数情况下可参考。
实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定最加反应条件。
用2PCRTaqMix产品，以人基因组DNA为模板，扩增0.5kb的片段，反应体系为25l。
如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量。
1.
将2×
qPCRSmartMix、模板DNA、引物以及去离子水在室温融化后混匀。
2.
准备PCR反应混合物。
冰浴中按下面的量加入各种反应物，混匀：
2qPCRSmartMix12.5l
Primer1（5M）1.25l
Primer2（5M）1.25l
Template0.5g
ddH2O补至25l
3.
按照下表所示，设置PCR扩增程序。
首次扩增某一模板时，一般先在延伸步骤采集数据，PCR反应完成后，进行融解曲线分析（见步骤5）。
以后扩增相同的模板时，可以根据融解曲线分析结果加入数据采集步骤（详见步骤6），以便获得更准确的定量结果。
步骤
时间
温度
说明
PCR起始激活步骤
10min
95°
C
激活TaqDNA聚合酶
3步或4步循环
变性
15sec
94°
退火
30sec
50-60°
比引物的Tm值大约低5-8°
C。
延伸
72°
如果未加入附加的数据获取步骤，则在这一步获取荧光数据。
可选：
数据获取
D°
引物Tm<
D<
产物Tm
循环数
35~40个循环
循环数与模板DNA的量相关
5.
进行PCR产物融解曲线的分析。
强烈推荐进行融解曲线分析，以验证PCR产物的特异性。
融解曲线分析是定量PCR仪配套软件中的分析步骤。
请根据仪器供应商的介绍进行操作。
一般而言，应当在65°
C~95°
C之间获取融解曲线数据。
引物二聚体的形成与引物设计及模板的拷贝数有关。
由于引物二聚体的融解温度较低，所以很容易与特异的产物区分开来。
6.
可选：
加入数据获取步骤后重复以前的循环。
为了消除由引物二聚体造成的荧光读数，可以在循环操作中加入数据获取步骤（见步骤3）。
温度设置应当高于引物二聚体的Tm值，但比特异性产物的Tm值大约低3°
在引物二聚体被同时扩增的情况下，这一方法可以提高检测的动态范围并提高定量的可信度。
7.
利用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物的特异性。
注意事项』
为了节约试剂，建议先用普通PCR优化好各种反应条件。
为了保证反应效率，使用SYBRGreenI进行荧光定量PCR时，扩增片段长度最好在50~500bp。
SYBRGreenI可以造成眼睛、皮肤及呼吸道的损伤，使用时请注意防护，最好佩带防护眼镜及手套。
4.
为了确保实验结果的可靠性，每次实验均应设置阴阳性对照。
本产品仅供科研使用。
请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。
使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术
采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）可以用来验证基因表达的差异。
我们在此报道了一种基于SYBRGreenI染料进行的实时PCR定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的基因表达差异的重复性。
因为SYBRGreenI染料是一种非特异性的结合染料，所以反应使用了"
热启动"
PCR以及通过经验性数据来确定退火以及检测产物的温度。
相对的基因表达水平可以通过使用一系列的cDNA浓度做出标准曲线来进行定量。
使用这种方法，实时PCR可以确定DNA阵列71%（17／21）的准确性，和91%（1／31）的差异显示的准确性。
验证DNA阵列的基因表达差异与杂交信号的强弱有关。
实时RT－PCR结果表明DNA表达差异在2－4倍间的差异无法判断其正确错误与否。
而差异显示PCR的结果验证不依赖于信号的强度。
无论是何种基因表达谱技术（微阵列，DDPCR，基因表达系列分析技术还是差异杂交技术），如果已经知道目的基因的序列，那么实时RT－PCR方法就可以适用于验证这些差异表达，因为它具有定量功能而且需要的RNA量比传统方法要低1000倍。
DNA阵列（微阵列）和差异RT－PCR方法是两种可靠的确证基因表达和基因组广泛转录本差异的方法。
这些技术确定样本表达差异的重复性和敏感性的可靠性受到几个因素的影响。
微阵列的实验结果受到阵列产物、RNA提取、探针标记、杂交温度条件和图像分析（1－4）的影响。
DD－PCR结果受到电泳分辨率、弱和差异引物、条带确证和结合部分的影响。
因为这些可靠性上的限制，被确定为差异表达的基因要经过另一种方法的检测。
Northern杂交或者RNA酶保护分析都是有效的但是至少要5mg的RNA。
传统的逆转录聚合酶链式反应（RT－DDPCR）要求的RNA要少一些，但其终点分析缺乏定量上的精确性（6－8）。
实时RT－PCR技术方法是当前最新的确定基因表达的方法，在这篇报道中，我们详细描述了使用实时PCR技术和其与DNA阵列以及DD－PCR技术的相互结合，来验证基因表达的正确性。
方法描述:
基本策略
为了满足验证表达谱研究确定的大量基因，我们研究了实时定量PCR系统并使用SYBRGreenI染料。
此外，还用每个基因的一系列已知浓度的模板制作了绝对定量曲线，以相对比较不同的样本。
相对定量曲线只需要使用在表达谱研究中确定的一个高表达样本中获得的cDNA的一系列稀释度制作完成。
尽管仍然需要设计基因特异性的引物，但不需要设计内在的基因特异性的荧光探针。
此外，反应的特异性由产物的Tm值确定（Tm：
DNA双螺旋一半解链时的温度）。
反应的特异性由"
PCR得到提高，并在低于产物Tm值1－2℃时获得信息。
这样就可以避免由通常来说Tm值较低的引物二聚体引起的非特异性信号（10）。
实时PCR的反应条件
逆转录反应条件
使用在基因表达谱分析中采用的总RNA进行验证实验。
采用SuperScriptFirstStrandSynthesisSystem进行RT-PCR（Invitrogen,Carlsbad,CA））反应来合成cDNA，反应体系为20ul，里面包含1mgDNaseI处理过的总RNA，20mMTris–HCl（pH8.4），50mMKCl，2.5mMMgCl2，10mMdithiothreitol（DTT），0.5mgoligo（dT）12–18,dNTP（各0.5mMdATP,dGTP,dCTP,和dTTP）以及200USuperScriptIIReverseTranscriptase。
混合组分时，先混合RNA和oligo（dT），70℃保温10分钟，再放到冰上并加入剩余的反应组分。
反应在42℃孵育1小时，然后再70℃加热15分钟终止反应。
cDNA再加入2U的RNaseH（Invitrogen）37℃孵育20分钟，再在70℃加热15分钟终止反应。
此外用一个没有逆转录酶的反应来验证是否有基因组DNA的污染（无RT对照）。
cDNA在使用前放置在－20℃保存。
进行实时定量PCR前不需要进行cDNA的纯化。
确定实时定量PCR的反应条件
使用GENSETOLIGOS,OligoVersion4,（GENSETCorp.,LaJolla,CA）或者LASERGENE的PRIMERSELECT软件（DNASTAR,Inc.,Madison,WI）计算产物的Tm值来确定反应的退火温度。
摸索退火温度时，每次以计算得到的Tm值增加或减少2－3℃，直到其与引物二聚体和非特异性产物间有3－5℃的差别。
信息采集时候的温度可以设置到特异性产物的Tm值以下1－2℃，以减少非特异性产物的干扰。
反应步骤和循环条件
所有的步骤按照仪器的使用说明进行。
按照试剂说明将包含有TagDNA聚合酶，dNTP,MgCl2,和SYBRGreenI染料的DNAMasterSYBRGreenI混合液与0.16mlTaqStartAntibody（Clontech,PaloAlto,CA）混合一起室温孵育5分钟，然后再加入引物和cDNA模板。
除此外，每个反应（20ul）中包含2ul的cDNA，0.4mM的引物和4mMMgCl2。
使用1:
200和1:
2000稀释的cDNA，但分析极微量的信息时要求更少的cDNA稀释度。
每个稀释度进行一个重复实验，同时用一个无模板的阴性对照，这些优化实验不用于标准曲线。
反应条件包括95℃先孵育60秒预变性和热启动，然后再进行50个循环，过程按优化好的实验结果进行。
并最终通过仪器进行一个融解曲线分析。
验证实验
实验条件
通过实验确定退火温度和信号读取温度后，就可以设置样品的相对基因表达反应了。
PCR的反应条件按上述进行。
相对定量曲线用两个重复的预测具有最高表达水平的样品的一系列cDNA的稀释度（1：
200,1：
2000和1：
20000）进行。
并人为地将其数值定为0.5、0.05和0.005。
未知模板的的cDNA稀释200倍。
每个基因都做一个无模板的对照，非RT-PCR对照只用一对引物来确定是否有基因组DNA的污染。
引物为G3PDH的引物，并同所有的稀释为1：
200的无RT模板进行比较。
反应温度也同上进行热启动过程并按照反应条件进行，同时也做融解曲线分析。
为了使结果可信，至少三个定量稀释度中的二个必须特异性的反应（以Tm值为交准），而无模板对照在比信号读取温度低的时候必须没有产物和引物二聚体。
如果只有一个稀释度产生了特异性产物，那么则需要重新调整稀释度来保证至少标准曲线上有两个可应用的点，如果引物二聚体影响了读板温度，就应该调整反应温度。
如果无RT对照通过融解曲线分析发现有产物存在，则应用DNA酶I来消除DNA污染。
计算
每组反应都用随机的软件进行分析，并按照软件的操作手册进行。
简单地来说，就要设定好域值线消除掉无信息的荧光背景信号，标准曲线由仪器自动按照设定好的值生成。
软件能为每个反应自动计算最终的浓度。
并最终得到样本的浓度和相关系数。
使用实时PCR技术验证基因表达:
当待检基因序列已知时可以用上述描述的定量RT－PCR的方法来验证不同基因表达方法（cDNA阵列，DD－PCR，基因表达系列分析以及杂交）得到的结果。
这里描述的是用实时定量PCR技术来检测与微阵列与DD－PCR方法得到的结果。
详细的步骤在图1中进行了描述。
验证DNA阵列结果
可用以上述描述的方法来验证任何阵列平台（cDNA或寡核苷酸）得到的基因表达差异。
例如，我们使用采用基于cDNA的高密度阵列（AtlasHumanCancercDNAExpressionArray;
Clon-tech）来研究W12脑上皮细胞的两个亚克隆（20863和20861）采用HPV16处理不同状态时的基因表达差异（9）。
用于验证的基因基于其杂交的荧光强度（亚克隆20863作为参考）和相对荧光强度（亚克隆20863与亚克隆20861）。
基因特异性引物来验证阵列结果
对于Clontech阵列来说，可以从制造商处获得基因特异性引物的信息。
在本例中，需要的只是合成引物。
如果没有此信息，可以设计基因特异性的引物（使用从GenBank中得到的序列信息）以用于验证结果。
引物应当为17–24个碱基长，产物大小为150–650bp。
产物太大的话不适用用于定量扩增。
避免基因家族的保守性区域可以得到更好的特异性结果。
实时RT-PCR与DNA阵列结果的比较
G3PDH是在大多数细胞中表达的含量丰富的看家基因，但在某些条件下的表达发生改变（11），通过DNA阵列杂交发现，G3PDH的转录本在亚克隆20863和20861中的表达相同。
实时定量RT-PCR也发现在两个亚克隆中有着相同的转录水平（9），实时PCR的忠实性可以由无RT和加水的对照以及每个基因的CV值得到证明。
每个高强度杂交的基因平均的CV值为12%（范围：
1-25%），而对于低杂交强度的基因来说则为18%（范围：
18-28%）。
表1计算相对表达水平以及变异系数
组1
0.447
0.0285
0.559
0.0226
平均值
0.503
0.0255
组内CV
15.7%
16.32%
组2
0.556
0.0203
0.45
0.0298
0.0250
14.9%
26.8%
组平均值
0.025
组间CV
15.32%
21.57%
相对表达水平（样品1／样品2）＝0.503／0.525＝20倍
变异系数＝标准偏差／平均值＊100
变异系数的值由RT－PCR的结果决定
.cDNA和实时PCR得到的基因表达结果的变化在表2中，实时PCR的结果表明了当杂交信号较高时大多数的cDNA差异结果（88%，15／17）或者是在不同亚克隆间表达水平的差异可以达到4倍的基因得到了确定（5／5）。
而在低强度杂交的样本中只有一个得到了确定（1／4）。
总的来说，实时定量PCR确定了81%（17／24）的基因。
cDNA阵列和实时PCR得到基因表达量上的差异也有差别。
例如，在14个由实时PCR验证的基因中，有10个表达的差异水平要超过由cDNA阵列确定的表达水平。
验证DD-PCR结果
DD-PCR条带的选择和基因特异性引物
DNA阵列和DD-PCR技术间主要的差别在于DD-PCR条带上并没有序列信息。
因此，验证的第一步就是要从DD-PCR结果胶中切下目的条带并从中回收DNA。
切下选择的条带按照荧光DD-PCR手册（BeckmanandCoulter,Inc.,FosterCity,CA）进行，PCR得到的反应结果按照DD-PCR的条件进行重新扩增，经凝胶回收后再进行测序。
将测序结果中未知序列小于10%的条带用于验证反应。
包含有混合序列的条带不适用于用于验证反应，除非能确定主要序列。
确定好序列后，就需要设计引物来进行上述的反应。
实时PCR和DD-PCR结果的比较s
在本例中，使用优化的荧光DD-PCR系统（BeckmanCoulter,Inc.）来验证未分化的单层细胞与亚克隆20861基因表达的差异。
按照荧光强度的不同，将条带相对的表达水平分为2-4倍，5-10倍和大于10倍。
根据绝对的荧光值将条带分为弱、中等和强三类。
（表3）。
条带I设计的引物得到的.扩增结果在所有的cDNA稀释度中均有重叠。
这表明了条带I在单层细胞与亚克隆中有着相同的表达，DD－PCR和实时PCR得到的结果有一致的。
不同稀释度得到的融解曲线（结果未显示）表明设计的引物均得到了特异性的结果，实时PCR用来验证了全部的13条差异片段。
弱及中等强度信号条带的CV值为10.4%（3－28.5）。
而对于强信号的条带来说则为18%（范围：
0.8%）。
实时PCR验证了除了一个外，全部的（1／13,92%）的DD－PCR结果代表了一个已知基因或EST。
而且不同信号强度的代表了不同相对表达水平。
技术细节:
•
RNA质量是所有基因表达分析中最重要的变数。
商业化的RNA提取试剂盒可以得到极好的纯度和无降解的RNA，这可以适用于酶的反应以及基因表达分析的检测系统。
RNA的完整性应当在长时间的保存过程中得到保证，因为基因表达谱分析有时候只能在RNA提取的数周或数月后才能进行。
总RNA应该用DNaseI（0.4u/mgRNA）按照试剂盒的要求进行处理。
RNA用UV分光光度计进行定量，并用甲醛的琼脂糖电流来检测降解程度（12）。
2．如果RNA的量有限（10mg），有另一种方法可以替代DNaseI处理（13）。
方法是在RT反应中加入逆转录酶之前先用DNaseI来处理RNA，以避免由酚——氯仿抽提时造成的RNA的损失。
我们在实时RT－PCR实验中验证了用DNaseI处理有限RNA样品的效果，非常令人满意。
3.如果实验样品RNA有限，可以用较易获得的同一种／基因型（人的来自cDNA的RNA或是来自鼠cDNA的鼠RNA）的RNA用于确定最优化的退火和信号读取温度。
但是，从这些资源得到的RNA应该按照样品处理的方法进行同样的处理，因为Tm值会受到残留盐和其它方法的影响。
4.有些引物对也许会在不同的引物退火温度和加热时间的情况下产生几个峰的融解曲线。
这也许表明引物存在非特异性或者是表达存在不同的剪接转录本或者发现有新的基因家族成员。
在这种情况下可以把反应样品从反应管中取出进行凝胶电泳并进行产物测序。
结论:
采用热启动PCR和在特异产物Tm值以上进行荧光信号读取可以使基于SYBRGreenI染料的实时PCR变得敏感而特异（10）。
这里描述的技术可以使cDNA阵列中高和低强度杂交信号和DD－PCR中低到高强度信号的每个基因的CV值为15%。
平均CV值低于通常报道的25－25%。
大部分通过cDNA阵列和DD－PCR方法得到的差异基因可以通过实时PCR技术得到确证（采用1：
200到1：
20000的cDNA稀释，20ul反应体系中加入1ul的模板RNA）。
因为实时PCR方法可以采用极低量的cDNA，验证由高通量方法得到的100－1000个基因只需要1mg的总RNA。
如采用Northern杂交或RNase保护方法进行验证，则至少需要5mg的总RNA，这接近于采用实时PCR反应分析的5000倍。
实时PCR技术验证的不同表达强度信号的DD－PCR条带表明了对DD－PCR条带的验证并不依赖于条带的信号强弱。
另一方面，杂交信号的强弱和基因的相对表达水平对cDNA阵列结果的影响也得到了验证。
与采用的筛选技术相比，实时PCR得到的结果在基因表达水平上有很大的不同。
这种不同也许是由于采用筛选技术和DD－PCR技术时没有办法采用特异性的引物来区分同一个基因家族。
除非DNA阵列技术采用了针对序列特异转录本的优化，否则cDNA阵列杂交结果就有可能被交叉杂交或重复制的基因家族成员所遮盖。
简单的，为DD－PCR条带设计特异性的引物也受到序列信息不足和新的转录本的限制。
实时PCR方法作为一种辅助的验证方法，有可能成为只使用少量RNA的情况下，定量大量已知和新基因表达变化的快速的新途径。
参考文献
Der,S.D.,Zhou,A.,Williams,B.R.G.,andSilverman,R.H.（1998）Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,15623–15628.
Eisen,M.,andBrown,P.O.（1999）MethodsEnzymol.303,179–205.
Winzeler,E.A.,Schena,M.,andDavis,R.W.（1999）MethodsEnzymol.306,3–19.
Schuchhardt,J.,Beule,D.,Malik,A.,Wolski,
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