多酚黄酮实验报告张阳杰.docx
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多酚黄酮实验报告张阳杰
植物中多酚与黄酮的提取与测定
报告题目
植物中多酚与黄酮的提取与测定
作者姓名
张阳杰
班级
1105
指导教师
倪明
完成时间
2014年3月
生物学实验教学中心
目录
引言3
1实验材料3
2实验步骤5
2.1样品的处理及提取5
2.2样品测定5
2.2.1黄酮测定5
2.2.1.1黄酮类物质的鉴定方法5
2.2.2黄酮类物质定量测定6
2.2.2.1标准曲线的制备6
2.2.2.2样品黄酮含量测定7
2.2.3多酚测定.......................................................................................7
2.2.3.1制作没食子酸标准曲线7
2.2.3.2多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法7
2.2.4抑制亚硝化反应8
2.2.4.1总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定8
2.2.4.2总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定8
3图片处理及现象分析9
3.1现象及图片9
3.2实验数据及数据处理10
总结12
参考文献13
植物中多酚与黄酮的提取和鉴定
张阳杰（指导老师：
倪明）
摘要：
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。
是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物。
植物中由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶A，经碳链延长环化生成的查耳酮，再衍生成的各种α-苯基衍生物。
黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。
此外，它还常与糖结合成苷。
天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。
组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。
黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。
黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。
这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。
黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。
糖链越长则水溶度越大。
黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。
酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。
黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，大多具有明显的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治疗心血管疾病等功能。
其中有些可用于心血管病的治疗。
植物单宁（Vegetabletannins），又称植物多酚（PlantPolyphenol）为多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。
在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，广泛存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达20%。
植物单宁是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物。
常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。
具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、防冠心病与中风等心脑血管病以及抗菌等多种生理功能，是自然界和人类的“健康卫士”。
2l世纪随着抗氧化剂理论及研究工作的深入，以及消费者对食品安全性意识的提高，天然抗氧化剂的应用越来越受到人们的重视，回归大自然已是目前一个大趋势。
关键词：
黄酮多酚
引言：
本实验以木芙蓉粉为主料，利用多酚、黄酮中官能团与其他化学物质的反应现象检验是否有多酚及黄酮的存在，并运用分光光度法定量检测出木芙蓉粉中多酚和黄酮的含量。
一、实验材料
仪器:
电子分析天平；粉碎机；数显恒温水浴锅；三用紫外仪；真空泵；分光光度计；电热套；比色管；常用玻璃仪器。
试剂：
（一）木芙蓉花采自湖北师范学院校区；芦丁（上海展云化工有限公司）；对氨基苯磺酸（分析纯）；柠檬酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；盐酸萘乙二胺（分析纯）；二甲胺（分析纯）；1-萘胺（分析纯）；钨酸钠（分析纯）；钼酸钠（分析纯）；没食子酸（分析纯）；（分析纯）；乙醇（分析纯）；A1（NO3）3（分析纯）；盐酸（分析纯）；NaOH（分析纯）；浓H2SO4（分析纯）；磷酸（分析纯）。
（二）学生自配试剂
1、乙醇溶液：
60%、80%乙醇溶液。
2、10%A1（NO3）3溶液。
3、1%三氯化铝溶液。
4、2％FeCl3溶液。
5、5%NaNO2溶液。
6、4%NaOH溶液；1%NaOH溶液。
7、5％的醋酸铅溶液。
8、1％KMnO4溶液。
9、10%、0.5%Na2CO3溶液。
10、pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液:
4.11mL0.2mol/L磷酸氢二钠与15.89mL0.1mol/L柠檬酸混合即可。
11、1mmol/L的二甲胺溶液。
12、1%、0.4%对氨基苯磺酸溶液。
13、0.1%1-萘胺溶液。
14、0.2%盐酸萘乙二胺溶液。
2、实验步骤
2.1样品的处理及提取
1.处理：
新鲜木芙蓉花水洗后，于60℃烘干，粉碎机粉碎，过筛备用。
2.提取：
精密称取干燥、粉碎的木芙蓉花粉末1.0000g置于锥形瓶中，加入60%乙醇溶液30mL，于60℃浸提2h，滤去残渣，残渣洗涤2-3次，定容至100mL，即得提取液。
2.2样品测定
2.2.1黄酮测定
2.2.1.1黄酮类物质的鉴定方法
（1）盐酸一镁粉反应：
取待测液1.0mL放在测试瓶中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，观察反应现象。
（2）氨水反应：
取待测液1.0mL放在测试瓶中，滴加几滴氨水振摇，观察反应现象。
（3）硝酸铝反应：
取待测液1.0mL放在测试瓶中，滴加几滴硝酸铝振摇，观察反应现象。
（4）三氯化铝反应：
取待测液1.0mL放在测试瓶中，滴加几滴1%三氯化铝振摇，观察反应现象。
（5）氯化铁反应：
在试管中加1mL提取物，再加入1.0mL的2％FeCl3，观察反应现象。
（6）浓硫酸反应:
在样品液中滴加少量浓H2SO4溶液，观察反应现象。
（7）碱性试剂显色反应在样品液中加入5%NaNO2溶液，摇匀，旋转6min后，加入等体积10%A1（NO3）3溶液，6min后再加入4%NaOH溶液，混匀，用60%乙醇稀释，观察反应现象。
（8）与5％的醋酸铅反应：
在5％的醋酸铅溶液中滴加数滴提取物，观察反应现象。
（9）与1％高锰酸钾溶液反应：
在试管中加1.0mL1％KMnO4，滴入3～4滴提取物，观察KMnO4溶液是否褪色。
（10）与碱性试剂（1％NaOH）反应：
在1mL提取物中加入0.5mL的1％NaOH，观察颜色变化。
2.2.2黄酮类物质定量测定
2.2.2.1标准曲线的制备
精密称取芦丁对照品10mg，置50mL量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，摇匀即得对照品溶液。
分别精密吸取1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL和5.0mL置于10mL比色管中，各加80%乙醇至5mL，加5%NaNO2溶液0.5mL，摇匀放置6min，再加10%A1（NO3）3。
溶液0.5mL，摇匀，再放置6min，加4%NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，在510nm波长处，以同法配制空白对照，测定吸光度值，得回归方程。
2.2.2.2样品黄酮含量测定
精密吸取提取液1.0mL于10mL比色管中，按“各加80%乙醇至5mL”起依法进行操作，同时精密吸取黄酮提取液1.0mL于10mL比色管中，加80%乙醇至5mL，再加1mL水，4mL4%NaOH溶液，作样品空白测定吸光度值。
按回归方程计算样品黄酮提取得率。
2.2.3多酚测定
2.2.3.1制作没食子酸标准曲线
精确称取0.070g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100mL的容量瓶中，配成浓度为700mg/L的没食子酸溶液。
然后分别精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0mL没食子酸标准溶液定容于50mL容量瓶内，配成浓度为0-56mg/L的系列标准溶液。
再从各系列标准溶液中吸取1mL于25mL比色管内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加1.5mLFolin-Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6mL10%Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30℃下避光放置反应2h，以试剂样为空白，在波长760nm处测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.2.3.2多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法
取1mL提取稀释液（样液稀释10倍）于25mL比色管内，加10mL蒸馏水，摇匀，再加1.5mLFolin-Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6mL10%Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30℃下避光放置反应2h，以试剂样为空白，在波长760nm处测定吸光值，根据绘制的标准曲线方程计算提取液中多酚含量（以没食子酸计），经进一步计算即得多酚提取得率。
2.2.4抑制亚硝化反应
2.2.4.1总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定
分别吸取50mg/L的NaNO2标准液1.0mL于6支25mL比色管中，再分别加入提取液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，加入pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10mL，37℃条件下反应1h。
加入质量分数0.4%对氨基苯磺酸2.0mL，摇匀静置5min，再加入质量分数0.2%盐酸萘乙二胺1.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀静置15min。
在确定的最大吸收波长λmax=540nm处测定吸光度，并计算总黄酮对亚硝酸钠清除率。
2.2.4.2总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定
分别吸取总黄酮提取液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，于6支25mL比色管中。
加入pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液10mL，1mmol/L的NaNO2溶液1.0mL，1mmol/L的二甲胺溶液1.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，在37℃条件下恒温1h。
用移液管吸取1.0mL上述溶液加到7cm2培养皿中，加入质量分数0.5%Na2CO3溶液0.5mL，于紫外分析仪（254nm波长）上辐照15min。
取出后加入质量分数1%对氨基苯磺酸1.5mL，再加入质量分数0.1%1-萘胺1.5mL，蒸馏水0.5mL，摇匀静置15min。
用分光光度计在确定的最大吸收波长λmax=525nm处测吸光度，计算总黄酮对亚硝胺合成阻断率。
3、图片处理及现象分析
3.1图片及现象
黄酮类物质的鉴定:
从左到右依次为：
①盐酸一镁粉反应，反应完后溶液呈橙红色，表明有黄酮类化合物；②氨水反应，反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物；③硝酸铝反应，反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物；⑤氯化铁反应，呈蓝绿色或绿色，表明含有酚类化合物；⑥浓硫酸反应，反应颜色变橙色，表明有黄酮类化合物；⑦碱性试剂显色反应，观察反应颜色变橙红色，表明有黄酮类化合物；⑧与5％的醋酸铅反应，有黄色沉淀产生的表示有黄酮类成分；⑨与1％高锰酸钾溶液反应，若褪色表明含有酚类化合物；⑩与碱性试剂（1％NaOH）反应，若呈黄色、橙色或红色，表明含有黄酮类成分。
3.2实验数据及数据处理
制作没食子酸标准曲线:
没食子酸体积
0
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
吸光度值
0.009
0.022
0.052
0.070
0.112
0.127
0.170
多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法
多酚含量的测定:
1
2
3
平均
吸光度值
0.166
0.167
0.162
0.165
样品A760=0.165，带入标准曲线根据制作标准曲线回归方程可得x=3.78
根据多酚提取得率按照如下公式计算
式中：
Y：
提取得率（%）；
V：
提取多酚液体积（mL）；
C：
提取原液中多酚的浓度（g/mL）；
M：
木芙蓉花质量（g）。
M=1.009gv=100ml
得到多酚提取含量为0.102﹪
抑制亚硝化反应
总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定:
根据石榴皮总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定
式中：
A0为未加样品溶液时NaNO2的吸光度（以试剂空白溶液为参比溶液）；
A为加入样品溶液后NaNO2的吸光度（以样品溶液为参比溶液）。
提取液体积
吸光度值
清除率
0
0.862
0
0.2
0.698
19.02%
0.4
0.663
23.09%
0.6
0.584
32.25%
0.8
0.467
32.95%
1.0
0.467
45.82%
2.0
0.421
51.16%
3.0
0.361
58.12%
总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定
根据总黄酮对亚硝胺合成阻断率按照如下公式计算
式中：
A0为未加样品溶液时NaNO2的吸光度（以试剂空白溶液为参比溶液）；
A为加入样品溶液后NaNO2的吸光度（以样品溶液为参比溶液）。
体积液体积
吸光度值
清除率
0
0.126
0
1.0
0.075
40.47%
2.0
0.052
58.73%
3.0
0.060
52.38%
4.0
0.058
53.96%
5.0
0.049
61.11%
四、总结与讨论
1）三用紫外分析仪采用波长分别254nm、365nm的石英紫外线灯管各一组及滤色片组成。
为层析板点样、定位照明，座内还装有一根普通荧光灯。
连接上电源后，打开“开/关”点亮灯管，即可将被检测的样品放在灯下观察分析，如果将仪器放置在暗室中或用黑布遮去亮光，效果更佳。
2）紫外滤色片不能和金属物体碰擦，不能受力，表面应保持干燥清洁，应该常用酒精或乙醚等擦拭，防滤色片霉变。
3）操作人员使用时，应将紫外线对准样品照射，避免照射到人体，最好戴上眼镜，以免对人体造成伤害。
4）由于多酚在光照、温度等的条件下极易发生变化，如分解等，因此在实验操作过程中需要进行避光处理来防止多酚的分解。
5）配制的Folin-Ciocalteu试剂过滤后的滤液溶剂不应成绿色，否则重配。
本实验对移液管的使用要求较高，也要求能熟练使用分光光度计。
由于实验中涉及较多溶液，加溶液时应小心谨慎，以防漏加或者错加溶液。
在这两天的实验中，在老师的领导下完成该次实验，其中遇到很多的问题都在大家的相互实验与讨论下得到的了证实，因此此次实验还是比较成功的。
具体的是需要注意实验的一些小细节方面，往往很多实验的不成功，大多原因都是因为不注意细节，从而做不出理想的实验效果。
参考文献
l.石榴皮总黄酮的提取工艺及抑制亚硝化反应，吴佳，解成喜，食品科学，2011,32,111-114。
2.人参果总黄酮含量的超声提取工艺研究，任雪峰，吴冬青，王永生，周国宏，王克众，朱学芳，食品工业科技，2011,32,307-310。
3.荠菜中总黄酮的提取及含量测定，刘春风，化工技术与开发，2011，40，11-13。
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