离子交换层析说明书模板文档格式.docx
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-O-CH2COO-
表一.CMBestaroseFastFlow特性。
项目指标
离子交换剂类型弱阳离子
总离子载量0.09-0.13mmol/ml
排阻限4×
106（球形蛋白）
骨架6%交联琼脂糖
颗粒类型球形,45-165μm
流速300–600cm/h*
工作温度4–40°
C
工作pH见图2
pH稳定性2-14（短期,CIP）
4-13（长期）
化学稳定性适合所有的缓冲体系
1MNaOH
8MUrea
6MGuHCl
70%乙醇
避免事项氧化剂
长期暴露（1星期,20°
C）
pH<
4
*15cm柱高,1bar压强,25℃,XK50/30柱。
图2的滴定曲线表明CMBestaroseFastFlow的pH工作范围,例如CM基团的pH工作范围。
图2.CMBestaroseFastFlow的滴定曲线
DEAEBestaroseFastFlow离子交换剂的特性
DEAEBestaroseFastFlow是一种弱阴离子交换剂,离子交换基团是二乙基氨基乙基,如下:
-O-CH2CH2-N+（C2H5）3H
表2DEAEBestaroseFastFlow的特性
项目指标
离子交换剂类型弱阴离子
总离子载量0.11-0.16mmol/ml
排阻限4×
Matrix6%交联琼脂糖
颗粒类型球形45-165μm
流速300–600cm/h*
工作温度4–40°
工作pH见图3
2-12（长期）
图3的滴定曲线表明DEAEBestaroseFastFlow的pH工作范围,例如,DEAE基团的pH工作范围。
图3DEAEBestaroseFastFlow滴定曲线
QBestaroseFastFlow的特性
QBestaroseFastFlow是一种强阴离子交换剂,其离子交换活性基团是季铵基,如下:
–O–CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+（CH3）3
表3QBestaroseFastFlow的特性
项目指标
离子交换剂类型强阴离子
总离子载量0.18-0.25mmol/ml介质
骨架6%交联琼脂糖
颗粒类型球形,45-165μm
流速400–700cm/h*
工作pH见图4
pH稳定性2-14（短期,CIP）
2-12（长期）
pH<
图4的滴定曲线表明QBestaroseFastFlow的pH工作范围,例如Q基团的pH工作范围。
图4QBestaroseFastFlow的滴定曲线
SPBestaroseFastFlow的特性
SPBestaroseFastFlow是一种强阳离子交换剂,其活性基团是磺丙基,如下:
–O–CH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO-3
表4SPBestaroseFastFlow的特性
离子交换剂类型强阳离子
总离子载量0.18-0.25mmol/ml
流速400–700cm/h*
工作温度4–40°
工作pH见图5
pH稳定性3-14（短期,CIP）
4-12（长期）
8MUrea
6MGuHCl
避免事项氧化剂
图5滴定曲线表明SPBestaroseFastFlow的pH工作范围,例如SP基团的pH工作范围。
图5SPBestaroseFastFlow的滴定曲线
2.装柱指南
CM,DEAE,QBestarose离子交换剂贮存在20%乙醇中,而SPBestarose离子交换剂则贮存在20%乙醇和20mM的醋酸钠中,使用前,将匀浆中的乙醇倒出,用起始缓冲液代替。
装柱说明
装柱的质量主要影响分离效果,请参照如下说明来检测,填装层析柱。
首先测量最适流速。
下面是用于测量带转接器并固定柱床的层析柱最适流速方法。
测量最适装柱流速:
最适装柱流速与温度、柱子大小型号、介质体积有关,因此,建议独立的装置都需分别测量最适装柱流速,测量方法如下:
1.精确计算所需介质的量（这对固定柱高的层析柱特别重要）。
1L填充柱所需的介质量大约是1.15L自然沉淀匀浆的量。
2.参照层析柱使用手册安装柱子。
3.开始以较低的速度填充柱子（30cm/h）。
4.不断增加压力,并记下压力稳定时的流速,不要超过柱子能承受的最大压力,或介质允许的最大流速。
5.当压力/流速曲线不再变化或层析柱承受的压力达到最大时,达到最大流速。
此时停止装柱,而且不要超过最大流速。
最适装柱流速/压力是最大流速/压力的70-100%。
6.制作压力/流速曲线见表1,测得最适装柱流速,实际操作时的流速/压力应小于最大流速/压力的70%。
3.装柱的评价
为了检查装柱质量,并对使用过程中质量监控,装柱完要立即检测柱效,然后定时检查,此时能够检查出分离效果是否正常。
我们用等高塔板、HETP、峰不对称因子、As等术语来衡量填充柱的性能,经过应用样品如1%丙酮,这些指标是很容易测得。
（有色的化合物和盐溶液避免使用,它们可能会与介质发生反应）
理论塔板数能够随着检测条件的变化而改变,因此它只能作为一个参考值。
仪器和条件保持不变得到的结果才有可比性,溶质、溶液、洗脱液、样品体积、流速、流动路径、温度等条件改变都影响结果。
为了得到最好的结果,应该控制样品在最大柱体积的1.0%,而且线性流速在15-30cm/h。
如果最大装柱量是由柱效来决定的,那么理论塔板数就能够在使用柱子时做为装柱量的参考。
测量HEPT和As的方法
为了防止样品的稀释,尽量接近柱子的进口处加入样品。
条件
样品体积:
1.0-2.0%柱体积
样品conc:
1.0%（v/v）丙酮水溶液,
0.8MNaCl或10×
buffer
洗脱剂:
水,0.5MNaCl水溶液或者是稀释的缓冲液
流速:
20–30cm/h
检测:
丙酮:
UV280nm;
NaCl,buffer:
电导率
根据UV曲线（或者是电导率曲线）计算HETP和As,公式如下:
HETP=L/N
N=5.54（VR/Wh）2
VR=保留体积
Wh=半峰宽
L=柱高
N=理论塔板数
VR和Wh的单位要相同.
为了方便比较柱效,经常会用到”还原塔板高度”这个概念,其计算公式是:
HCTP/d
其中d是颗粒的直径,一般来说,这个指标小于3才是正常的。
峰形应该是对称的,不对称因子要尽量接近1（0.8-1.5一般是能够接受的）。
峰形发生变化往往是柱床变差的首要标志。
峰不对称因子的计算:
As=b/a
其中:
a=在10%峰高处的第一个半峰宽
b=在10%峰高处的第二个半峰宽
图6表示丙酮典型的UV吸收色谱图,并从该图中能够计算HETP和As。
图6在测定HEPT和As时丙酮典型UV吸收图谱。
柱子:
BPG300
介质:
Bestarose6FastFlow
株高:
57.5cm
柱体积:
40.6L
样品:
1.05L（1%丙酮）
洗脱液:
蒸馏水
19cm/h
Wh=0.9
HEPT=0.024cm
a:
0.9
b:
0.85
As:
0.94
4.保养
为了长期保持Bestarose快速离子交换剂的最佳性能,请参照以下操作。
平衡
装柱完,用5倍柱床体积的washingbuffer平衡柱子。
再生
分离后,用高离子强度的缓冲液（例如1MNaCl）和/或增加PH值来洗柱,然后用至少5倍柱床体积的startingbuffer平衡柱子,或直到柱子流出液的电导率和pH值稳定时。
清洁
在位清洁主要是去除再生后残留在柱子中的污染物,包括脂质、沉淀物或变性蛋白。
这些污染物可能在分离未预先处理的样品时残留。
定期清洁不但能够防止这些污染物的固定,还能够保持介质的载量、流速及一般性能。
每次清洁应根据不同的污染物制定清洁措施,清洁的频率主要由分离样品的性质和条件所决定,建议分离1-5次后清洁一次。
标准的清洁流程
因离子交换而吸附的蛋白质,能够用0.5胶床体积的2MNaCl溶液反方向洗柱10-15分钟。
沉淀、疏水性蛋白和脂蛋白时,可用1MNaOH溶液以40cm/h的线性流速反方向洗柱1-2小时。
去除吸附性强的疏水性蛋白和脂质时,用2-4倍柱床体积的0.5%无离子的去污剂（如1M醋酸）反向洗柱1-2h。
同样能够用2-4倍柱床体积的高达70％的乙醇或30％异丙醇反方向洗柱1-2h。
（*特别说明:
当使用70%乙醇时,需要在防爆的区域或设备。
）
净化
为了降低柱床中微生物污染,用0.5-1MNaOH反向洗柱1h。
上述的清洁步骤同样能够净化柱子。
灭菌
只能采用高压灭菌处理。
用pH7,0.5MNaCl平衡柱子,倒出介质,120℃高压灭菌介质30min。
参考层析柱使用手册对柱子的灭菌处理,然后再重新安装、填柱并检测。
保存
未用过的介质能够贮存于4-30℃,确保容器盖子拧紧。
填充柱用workingbuffer平衡后贮存于20%乙醇中,以防微生物生长。
5．疑难解答
高背压
1.检查泵与收集管间所有的阀门是否都是完全打开的。
2.检查所有的阀门是否干净的,且没有堵塞。
3.经过清洁,去除吸附性强的杂质。
4.按照层析柱使用指南,检查柱子各个部分如滤器、滤网等。
未预料的层析结果
1.检查记录速度/信号。
2.检查流速。
3.检查缓冲液。
4.检查转接器与柱床之间没有间隙。
5.检查填充柱的性能,见14页。
6.检查预处理样品产生的变化情况。
表5.离子交换层析的实验条件是如何影响分离步骤中的主要参数。
优化后的关键参数能够帮助达到理想的分离结果,而且有助于制定一套经济有效的分离方案。
条件分离目标
选择性柱效载量
（理论塔板）
产量结合能力
（g/hg/L介质）
吸附时pH影响极大影响影响极大
解析时pH影响极大
吸附时传导率（ms-1）大幅度增加
-----影响影响影响
增加流速（cm/h）减低大幅度增加减低
增加柱高（cm）增加增加减少
增加柱子直径（cm）大幅度增加
降低颗粒直径（cm）大幅度增加增加
微生物侵染
1.检查接口和预滤器。
2.检查上样成分如缓冲液、样品组分等。
3.检查柱子是否得到恰当的清洁。
气泡
1.检查缓冲液与柱子温度是否一致。
2.检查接口是否松懈,阀门是否漏液。
如果空气进入柱子,需重新装柱。
如果少量空气进入柱床顶部,或者在转接器网与接口处,用流动相反向冲洗即可,然后检查柱效（见14页）,并与检查前结果相比较。
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