Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建Word文件下载.docx

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糖蛋白根据糖基和蛋白质的连接方式不同，可分为2大类，即O-连接和N-连接糖蛋白。

其中，对N-连接糖蛋白的糖基化修饰研究得比较透彻，其修饰序列极端保守，即在Asn-X-Thr/Ser（X为除Pro外的任意氨基酸）的Asn残基上。

目前重组糖蛋白药物的生产主要是哺乳动物细胞表达系统。

但该系统培养成本高、生产周期长[2]。

因此，利用酵母细胞来替代哺乳动物细胞生产重组蛋白药物已日益受到人们的重视。

酵母表达系统具有原核细胞系统生长速度快、便于基因操作和可工业化大规模培养等优点，同时又具有真核细胞大部分的翻译后加工修饰能力，因而广泛用于各种蛋白的表达[3]。

巴斯德毕赤酵母属于甲基营养型酵母，是第2代酵母表达系统的代表，作为成熟的表达系统，它还具有表达量高、较稳定、可分泌、易纯化及成本低等优点[4-7]，但目前主要应用于非糖蛋白的生产，这是因为当毕赤酵母表达系统用于多数重组糖蛋白药物的生产时，还存在一些问题，其中最关键的是毕赤酵母对糖蛋白的过度糖基化修饰，即形成不同于哺乳动物细胞的杂合型或复杂型糖基结构，而是高甘露糖型糖基或过度糖基化结构[8-9]，这种高甘露糖型糖基结构的糖蛋白在人体中容易被清除、半衰期较短、且易产生较高的免疫原性；

同时对某些蛋白过度的糖基化修饰也会造成产物的分子量不均一，或者一些活性位点的遮蔽[10]，影响其功能和活性。

这些都限制了毕赤酵母在糖蛋白类药物生产方面的应用。

酵母和哺乳动物N-糖基化修饰途径在内质网中的起始步骤都是相同的，在内质网中，在寡糖转移酶作用下，Glc3Man9GlcNAc2被连接到新生肽链的专一序列上，即Asn-X-Thr/Ser的Asn残基上，随后在葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ和内质网甘露糖苷酶I（MnsI）的作用下，蛋白的糖基最终被加工成Man8GlcNAc2糖基，并转运至高尔基体。

在高尔基体内，酵母和哺乳动物糖基修饰过程明显不同，在酵母高尔基体中，由于存在一个关键起始酶α-1,6-甘露糖转移酶（Och1p），Man8GlcNAc2糖基在它的作用下接受第一个α-1,6-甘露糖，形成Man9GlcNAc2糖基，该糖基是α-1,2、α-1,3甘露糖转移酶及一些磷酸甘露糖转移酶的底物，在这些甘露糖转移酶的作用下，蛋白的糖基可以被加至数十至上百个甘露糖，形成高甘露糖，发生过度糖基化修饰[10]；

而在哺乳动物高尔基体内，蛋白的糖基在α-1,2甘露糖苷酶I（MDSI）的作用下，Man8GlcNAc2糖基会被剪切去除3个α-1,2连接的甘露糖，而形成Man5GlcNAc2糖基，这一糖基是哺乳动物细胞合成杂合型和复杂型糖基的前体，也是哺乳动物表达的甘露糖型糖蛋白的主要糖型，如牛核糖核酸酶B（RibonucleaseB）。

而这种糖基在酵母中并不存在，所以这一结构也是酵母和哺乳动物N-糖基化修饰过程的“分界线”。

我们前期已经敲除了Och1这一形成高甘露糖型糖基结构的关键酶基因，获得了过度糖基化缺失的毕赤酵母菌株GJK01（ura3、och1）[11]。

本研究拟通过选择不同物种来源MDSI及其定位信号，并实现其在GJK01（ura3、och1）中的融合表达，以获得从酵母糖基向哺乳动物糖基改造的第一个关键糖型，即Man5GlcNAc2结构。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株

α-1,6-甘露糖转移酶（Och1p）基因缺陷的毕赤酵母GJK01（ura3、och1）菌株由本室构建。

HSA/GM-CSF表达载体pHIL-D2/HSA/GM-CSF、PGE1203-URA3均由本室构建保存[11]。

载体pPICZαA、pIB2、毕赤酵母GS115均购自Invitrogen公司。

HepG2细胞由本室保存。

1.1.2试剂和仪器

培养基和试剂：

酵母抽提物、蛋白胨均为Oxoid公司产品；

无氨基酸酵母氮源（Yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，YNB）为Difco公司产品；

所用限制性内切酶、T4DNA连接酶和去磷酸化酶（CIAP）均为大连宝生物工程有限公司产品；

牛核糖核酸酶B（RNaseB）、氢化硼氰化钠（NaBH3CN）均为Sigma产品；

Sephadex-G10柱色谱填料（AB）；

DNA3100测序仪（ABI）；

8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸（8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，APTS）（Molecularprobes）；

碳黑柱（Alltechassociates）。

1.2α-1,2-甘露糖苷酶（MDSI）表达载体的构建

1.2.1PGE-URA3-GAP1载体构建

GAP启动子基因的获取：

以pGAP01和pGAP02为引物，以毕赤酵母表达载体pIB2为模板，PCR扩增500bpGAP启动子基因片段；

CYCTT终止子基因的获取：

以pCYCTT01和pCYCTT02为引物，以毕赤酵母表达载体pPICZαA为模板，PCR扩增300bp的CYCTT终止子基因片段；

然后通过引物pGAP01和pCYCTT02，利用PCR方法融合GAP和CYCTT，获得GAP表达盒，片段大小约800bp。

利用KpnⅠ/XbaⅠ酶切该片段，并与经过同样酶切的pGE1203-URA3进行连接，获得含GAP表达盒的载体pGEURA3-GAP。

利用一对互补配对的寡核苷酸引物1203MSC5、1203MSC3，退火形成双链，构建至pGEURA3-GAP载体中，获得含有多克隆位点SspI-Sse838I-SwaI的载体，命名为pGEURA3-GAP1载体。

1.2.2载体PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI的构建

定位信号的克隆：

以酿酒酵母基因组为模板，以pMnsI5、pMnsI3为引物，PCR扩增90bp的MnsI定位信号，以pSCsec12-5、pSCsec12-3为引物，PCR扩增300bp的Sec12定位信号；

以乳酸克鲁维酵母基因组为模板，以pKLsec12-5、pKLsec12-3为引物，PCR扩增300bp的Sec12定位信号。

将扩增得到的3种定位信号基因片段分别用Sse8387Ⅰ/SspⅠ酶切，构建至同样酶切的pGE-URA3-GAP1载体中，获得3种pGE-URA3-GAP1-signal载体。

MDSI基因的克隆：

从人的肝癌细胞HepG2中提取总RNA，以pHmdsi（Δ185）、pHMDSI3为引物，RT-PCR扩增1800bp人源的编码缺失N端185个氨基酸但包含完整C端催化区的MDSI基因片段，记为HMDSI（Δ185）；

从植物拟南芥叶片中提取总RNA，以pATMDSI5（Δ48）、pATMDSI3为引物，RT-PCR扩增1700bp拟南芥的编码缺失N端48个氨基酸但包括完整C端催化区的MDSI基因片段，记为ATMDSI（Δ48）。

利用Sse8387Ⅰ/SwaⅠ酶切位点将2种基因片段分别构建至3种pGE-URA3-GAP1-signal载体中，获得6种载体PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI。

1.2.3表达载体PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI的构建

为了实现MDSI表达载体在酵母基因组中的定点整合，本研究选取了磷酸甘露糖转移酶PNO1基因开放读码框ORF上游同源序列作为整合位点。

因此，以毕赤酵母GS115基因组为模板，以PNOI5-5、Pno为引物，PCR扩增PNO1基因ORF上游序列，片段大小为1000bp左右，电泳回收，然后，再以回收产物与PNOI3-3为引物，以毕赤酵母GS115基因组为模板，PCR扩增2000bp左右基因片段，电泳回收，回收产物利用KpnⅠ/XbaⅠ酶切位点克隆至pGE-URA3-GAP载体中，获得pGE-URA3-PNOI载体；

NotⅠ酶切6个基因载体PGE-URA3-GAP-signal-MDSI，将获得的带有MDSI基因的表达盒克隆到限制性内切酶NotⅠ酶切并CIAP去磷酸化的pGE-URA3-PNOI载体中，获得表达载体PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI。

1.3HSA/GM-CSF（His6-tag）在过度糖基化缺陷菌GJK01（ura3、och1）中的表达及鉴定

制备GJK01（ura3、och1）的电转化感受态细胞，将pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag）以限制性内切酶NotⅠ线性化后电转入感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有尿嘧啶和精氨酸的MD培养基（YNB1.34%，生物素4×

10−5%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，精氨酸100μg/mL，尿嘧啶100μg/mL）上。

5~8d后，随机挑取克隆接种到2mLYPD培养基中，25℃培养48h后，以5%的接种量接种到BMGY培养基中，24h后加入0.5%甲醇进行诱导表达，每12h补加1次甲醇，诱导72h后离心取上清，上清用于融合蛋白的表达分析，筛选HSA/GM-CSF（His6-tag）在缺陷菌GJK01（ura3、och1）中的表达株。

1.4MDSI在GJK01（ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag）中表达及鉴定

制备HSA/GM-CSF（His6-tag）在GJK01（ura3、och1）中的表达株的感受态细胞，将6种PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI分别以位于PNOI基因ORF上游手臂上的限制性内切酶BamHⅠ酶切，线性化后分别电转入感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有精氨酸的MD培养基（YNB1.34%，生物素4×

10−5%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，精氨酸100μg/mL）上。

5~8d后，对长出的URA3+菌进行基因组鉴定，鉴定引物为MDSI钓取引物。

将鉴定得到的MDSI转入的阳性菌接种到2mLYPD培养基中，25℃培养48h后，以5%的接种量接种到BMGY培养基中，24h后加入0.5%甲醇进行诱导表达，每12h补加一次甲醇，诱导72h后离心取上清，上清备用。

1.5HSA/GM-CSF（His6-tag）的纯化

收集培养上清，利用镍亲和层析方法纯化末端带有6个His标签的报告蛋白HSA/GM-CSF。

流动相为20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.5，洗脱液另含0.5mol/L咪唑。

在280nm处紫外吸收峰值收集纯化产物，10%的SDS-PAGE鉴定表达产物。

1.6HSA/GM-CSF（His6-tag）的糖基分析

1.6.1HSA/GM-CSF（His6-tag）糖基的释放

蛋白在0.5%SDS和1%β-巯基乙醇变性缓冲液中100℃变性10min，然后在含有50mmol/L磷酸钠（pH7.5）、1%NP-40、N-糖苷酶F（PNGaseF）的溶液中37℃酶切16h，使HSA/GM-CSF（His6-tag）释放糖基。

1.6.2HSA/GM-CSF（His6-tag）糖基的纯化

用80%乙腈、0.1%三氟醋酸活化碳黑柱，20%乙腈、0.05%三氟醋酸洗脱，所得糖链真空冷冻抽干备用。

1.6.3APTS标记糖链

取糖链样品，加0.02mol/L的APTS溶液1μL[溶于1.2mol/L柠檬酸]，1mol/L的NaBH3CN溶液1μL（溶于DMSO）。

混匀，封管，置37℃水浴反应18h。

1.6.4APTS标记糖链SephadexG10纯化

据文献[12]报道该方法简单，可除去约90%的单体APTS，同时能保留约70%以上的标记物复合物。

样品经G10两次纯化后真空抽干。

1.6.53100DNA测序仪分析APTS标记糖链[17]

5μL纯水溶解G10纯化且冷冻抽干的APTS标记糖链。

最终待测样品中含1μL样品，8μL去离子甲酰胺和1μLROX修饰内标混合物，其中ROX内标混合物是指由罗丹明修饰的6-、30-寡核苷酸（由5′-TAC-3′重复序列组成，由Invitrogen公司PAGE纯化得到）。

上样后利用标准的36cm毛细管及POP-6胶（ABI）分离，并利用GeneScan3.7软件进行数据分析。

2结果

2.1HSA/GM-CSF（His6-tag）在P.pastorisGJK01（ura3、och1）中表达

为了分析外源的MDSI在GJK01（ura3、och1）中的活性，本研究以HSA/GM-CSF（His6-tag）作为报告蛋白。

为此，必须获得HSA/GM-CSF（His6-tag）在GJK01（ura3、och1）中的表达菌株。

将表达质粒pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag）转入毕赤酵母GJK01（ura3、och1）后，随机挑取克隆，接种至BMGY进行诱导表达，取培养上清进行SDS-PAGE分析，1、2、4、5、7号克隆在分子量接近97kDa处出现一条蛋白条带（图1），而非糖基化的HSA/GM-CSF（His6-tag）分子量为85kDa，提示该条带为糖基化的HSA/GM-CSF（His6-tag）。

2.2α-1,2-甘露糖苷酶（MDSI）表达载体的构建及其转化GJK01（ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag）基因组鉴定

构建的α-1,2-甘露糖苷酶（MDSI）表达载体（图2），包含PNOI基因ORF上下游各1000bp的同源臂、GAP启动子、目的基因及其定位信号、CYCTT终止子。

其中，两种不同来源的MDSI基因：

人源的编码缺失N端185个氨基酸但包含完整C端催化区的MDSI基因[HMDSI（Δ185）]和拟南芥的编码缺失N端48个氨基酸但包含完整C端催化区的MDSI基因[ATMDSI（Δ48）]；

3种不同的定位信号：

酿酒酵母MnsI（ScMnsI）的内质网定位信号、酿酒酵母Sec12（Scsec12）的内质网定位信号以及乳酸克鲁维酵母Sec12（KLSec12）的内质网定位信号，分别组合，构成6种表达载体（表2）。

定位信号扩增的片段，琼脂糖核酸电泳如图3A所示，在90bp左右、300bp左右有特异的扩增产物片段，分别与ScMnsI、Scsec12、KLSec12的定位信号大小一致；

MDSI基因克隆的片段，琼脂糖核酸电泳如图3B、图3C所示，在1800bp左右、1700bp左右有特异的扩增片段，分别与HMDSI（Δ185）、ATMDSI（Δ48）大小一致。

最终获得的表达载体PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI经NotI酶切分析，发现有约2.5~3.0kb的基因表达盒片段与理论值一致（图4）。

并且经过测序分析显示表达载体PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI构建成功。

将3种定位信号（ScMnsI的定位信号、Scsec12的定位信号、KLSec12的定位信号）与2种来源的MDSI（人源的及拟南芥来源）表达载体电转化GJK01（ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag）菌，对转化菌基因组进行PCR鉴定，筛选MDSI基因整合到酵母染色体上的重组菌，1800bp左右的条带与MDSI大小一致（图5）。

2.3HSA/GM-CSF（His6-tag）糖链的制备与分析

利用PNGaseF酶对MDSI转化GJK01/（ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF（His6-tag））基因组鉴定正确的克隆中表达的报告蛋白HSA/GM-CSF（His6-tag）进行酶切，利用SDS-PGAE对酶切的报告蛋白分析，发现HSA/GM-CSF的糖基经PNGaseF酶切后，分子量减小，说明其N-糖链被PNGaseF酶切除（图6）。

PNGaseF酶切报告蛋白HSA/GM-CSF（His6-tag）后，样品经碳黑柱纯化获得糖链，APTS标记糖链。

由于单体APTS的存在会影响糖链分析，所以再用SephadexG10柱纯化标记糖链，以去除单体APTS。

然后利用3100DNA测序仪分析APTS标记、纯化的报告蛋白糖链，并利用GeneScan3.7软件进行数据分析，分析结果如图7所示。

从图7A中可以看出，α-1,6-甘露糖转移酶（Och1p）基因缺陷的毕赤酵母GJK01（ura3、och1）表达的报告蛋白HSA/GM-CSF（His6-tag）的糖基是Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2高甘露糖型糖基，其中Man14GlcNAc2、Man15GlcNAc2占绝大部分。

而将酿酒酵母MnsI基因内质网定位信号与编码拟南芥MDSI（Δ48）基因进行融合，并将这一融合基因整合到GJK01基因组诱导表达后，糖基分析发现拟南芥MDSI能在酵母GJK01（ura3、och1）宿主菌中发挥了较好的生物活性，能够将酵母GJK01中表达的报告蛋白的糖基Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2绝大部分剪切成Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2结构（图7B），这与哺乳动物来源的牛核糖核酸酶B的Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2甘露糖型糖基一致（图7C）。

通过本研究，我们利用酿酒酵母MnsI内质网定位信号与外源拟南芥MDSI（Δ48）基因的融合表达，在GJK01（ura3、och1）基础上，构建了具有合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白能力的毕赤酵母表达系统。

这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基奠定了基础。

3讨论

酵母糖基工程改造是在酵母中模拟哺乳动物的糖基修饰过程，即阻断酵母形成高甘露糖型糖基，引入外源的参与糖基修饰的酶基因，并将其定位在适当位置，使其发挥活性对糖基进行修饰，从而获得类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基的过程。

哺乳动物中的糖苷酶或糖基转移酶对糖基修饰是逐个顺序完成的。

Man5GlcNAc2是杂合型糖基修饰酶N-乙酰葡萄糖胺转移酶（GnTI）的底物，在GnTI的作用下，Man5GlcNAc2上添加一个N-乙酰葡萄糖胺，形成GlcNAcMan5GlcNAc2杂合型糖基。

因而获得Man5GlcNAc2糖基是酵母糖基化改造中的关键一步，没有Man5GlcNAc2结构，GnTI就很难发挥作用进而会影响到后续酶的进一步加工。

酵母糖基工程改造是一个复杂的系统工程，这其中涉及到诸多因素。

例如要实现外源基因的高效表达，需解决以下3个方面的问题。

第一，基因来源的选择，作为异源表达必须考虑外源基因在酵母中的活性问题，即酵母内环境、pH值、最适温度等等。

我们优先选择了哺乳动物自身来源的基因以获得哺乳动物的糖基结构，如本研究中的MDSI基因。

但由于人体温度在37℃左右，与酵母生长温度25℃~30℃存在差异，因此又选择了植物来源的基因，其生存环境温度范围很广，包含了酵母生长温度。

参与糖基化修饰的酶都是II型膜蛋白（如MDSI），II型膜蛋白的共同特点是，具有N端的氨基端细胞质尾、穿膜锚定区、茎区以及C端的催化区[13]。

本研究中我们保留了不同长度的茎区和完整的C端催化区。

其次，外源基因的准确定位问题。

糖蛋白的糖基是蛋白经过内质网，内侧、中间和外侧高尔基体过程中逐个顺序添加上去的，因此，模拟哺乳动物的糖基修饰过程，将酶定位在准确位置是必要的。

为了将MDSI定位于糖基化修饰的初始环境中，即内质网或内侧高尔基体，本研究选择酿酒酵母MnsI、Sec12的定位信号和乳酸克鲁维酵母Sec12的定位信号。

第三，启动子问题，我们选择了GAP启动子。

一般用于毕赤酵母表达的醇氧化酶（AOX）启动子属于强启动子，它需要甲醇诱导，存在一定的毒性隐患，不便于操作；

GAP启动子不需要甲醇诱导，是一种中等强度的组成型启动子，是一种成熟的用于酵母表达的启动子，例如人壳多糖酶基因在GAP调控下连续表达超过1个月，表达量稳定在300mg/L[14]。

同时，GAP启动子在AOX启动报告蛋白（HSA/GM-CSF）之前，就启动MDSI基因的表达，使得MDSI能更好地修饰随后表达的报告蛋白。

本室在构建酵母缺陷菌时，利用了URA3作为营养缺陷型筛选标记，URA3是一种常用的筛选标记，可以用来进行正负筛选。

缺陷菌GJK01为URA3缺陷型[11]，本研究构建的表达载体以URA3为筛选标记，当MDSI表达载体被转入工程菌GJK01中时，在目的基因MDSI被整合至基因组的同时，URA3也被整合至基因组，重组酵母菌可以在无尿嘧啶的培养基上生长，得到URA3+MDSI菌株；

进一步可以利用5-氟乳清酸（5-FOA）使URA3+菌株发生第2次重组，即URA3基因重新被剔除出基因组，从而再次获得URA3的缺陷菌株，该筛选标记将运用于下一次基因的敲除。

如本实验前期利用URA3基因已经成功敲除了毕赤酵母的Och1p[11]和乳酸克鲁维酵母的Och1p和Mnn1p（α-1,3-甘露糖转移酶）[15]。

HSA/GM-CSF（His6-tag）是本实验室构建的HSA与GM-CSF的融合蛋白，GM-CSF即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，由127个氨基酸组成，有2个N-糖基化位点（Asn27、Asn37），天然的GM-CSF约有34%的糖基化[16]。

为了对糖基进行有效分析，本研究采用了基于DNA测序仪荧光辅助糖电泳（DNAsequencerassistedFACE，DSA-FACE）[14]的方法，现在用于糖基分析的方法大都是荧光辅助糖电泳（FACE）、质谱（MS）、核磁共振（NMR），这些方法需要大量的样品，而且很难做到高通量。

DSA-FACE是借助于DNA测序仪的一种新型的荧光毛细管电泳方法，在常规的FACE的基础上建立起来的一种高灵敏度的糖分析方法。

它用毛细管电泳代替了传统的PAGE胶，用荧