C反应蛋白正确度验证物质的定值及应用Word文档下载推荐.docx
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每个系统分别测3次取均值，最终取两个系统的测定均值为CRP：
0.27mg/L）。
2．定值检测系统：
（1）西门子2400全自动生化仪配德国西门子原厂试剂、校准品及质控品；
（2）西门子2400全自动生化仪配德国德赛试剂、校准品及质控品；
（3）西门子2400全自动生化仪配国产利德曼试剂、校准品及质控品；
（4）西门子2400全自动生化仪配德国罗氏试剂、校准品及质控品；
（5）贝克曼Immage800全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及伯乐质控品；
（6）贝克曼AU5821全自动生化仪配贝克曼原厂试剂、校准品及质控品；
（7）贝克曼AU5821全自动生化仪配北京九强试剂、校准品及质控品；
（8）贝克曼AU5821全自动生化仪配日本积水试剂、校准品及质控品；
（9）贝克曼AU5821全自动生化仪配宁波美康试剂、校准品及质控品；
（10）西门子BNⅡ全自动免疫分析仪配原厂试剂、校准品及质控品。
（1）～（5）北京朝阳医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法，共5个检测系统：
（6）～（10）北京潞河医院检验科的4个透射比浊法和1个散射比浊法，共5个检测系统。
3．正确度验证的实验室及检测系统：
北京地区采用常规CRP生化或免疫检测系统的42家医疗机构临床实验室。
生化检测系统为开放式，包括：
BeckmanAU系列15家，HITACHI系列7家，Roche系列2家，西门子2400系列2家及其他品牌5家；
免疫检测系统为封闭式，包括：
BeckmanImmage8007家，西门子BNP系列4家。
二、多家实验室多系统联合定值
1．检测系统的选择：
根据卫生部临床检验2015年第1次EQA的851家实验室统计数据，从众多CRP检测仪器中选出目前使用率较高的4种主流仪器：
SiemensBNII/BNProspec（22.8%）、BeckmanIMMAGE/IMMAGE800（21.6%）、BeckmanAU系列（9.7%）和SiemensADVIA1800/2400（1.7%）；
在试剂选择上选出了全国使用率较高的8种CRP试主流试剂，包括：
Beckman、Roche、Siemens、北京利德曼、日本积水、DiaSys、北京九强、宁波美康，使用率1.6%～23.0%；
随后在两家三级医院将其组合为以上的10个检测系统：
2个采用速率散射比浊法的封闭系统和8个采用增强透射比浊法的开放的检测系统。
对10个系统分别做性能验证并在通过后的一周内完成定值。
以这10个CRP血清学检测系统来作为CRP正确度验证物质的定值系统。
2．ERM－DA474工作曲线工作液的配制：
根据IFCC的ERM－DA474国际标准物质说明书。
每瓶ERM－DA474血清CRP浓度为（41.2±
2.5）mg/L。
取ERM－DA474冰冻人血清标准物质6支，严格按照说明书进行复溶。
混匀后用加样枪取样，用CRP低值血清（0.27mg/L）作为稀释液，用分析天平称量法测重量，精确配制工作曲线标准溶液；
最终用称重法将ERM－DA474稀释成4个浓度水平，具体配制如表1所示，标记为W1－W4，－80℃冻存备用，实际浓度的计算公示如下：
表1
称重法稀释ERM－DA474国际标准物质
C1表示C反应蛋白国际标准物质中C反应蛋白的浓度；
ρ1表示C反应蛋白国际标准物质的密度；
M1表示C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中C反应蛋白国际标准物质的质量；
C2表示稀释液中C反应蛋白的浓度；
ρ2表示稀释液的密度；
M2表示C反应蛋白国际标准物质的稀释溶液中所述稀释液的质量；
ρ3表示C反应蛋白国际标准物质和稀释溶液混合后的密度；
C表示C反应蛋白国际标准物质和稀释溶液混合后的理论浓度
3．正确度验证物质定值工作液的配制：
水平2（L2）理论值（约25.3mg/L）在工作曲线线性范围内，因此无需稀释。
水平1（L1）理论值（约110.0mg/L）超出工作曲线线性范围，故将L1标物用低值血清稀释成两个浓度即U3和U4后，再进行定值，U3和U4与ERM－DA474的稀释液（W1～W4）的配制采用同一CRP低值血清（0.27mg/L），具体配制见表2,L2、U3和U4每种共配制12支，每支1500μl，放－80℃冻存备用。
表2
称重法稀释正确度验证物质
4．所有定值样本的密度测定：
由于CRP的准确定值计算过程中需要各种工作液的密度，所以在配制完成后，分装冻存前用称重法准确测定每种工作液密度：
公式：
ρ＝m/v，采用有检定合格证书的加样枪吸取200μl，经检定合格的分析天平称重计算，每份测定3次取均值（表3）。
表3
称重法测定样本密度
5．多系统定值：
每个实验室均分两天进行多系统联合定值，每天测定前将配制分装好的待测样本从－80℃冰箱中取出，实验室间采用冰袋运送，1h内送达定值实验室，放置室温待完全复融后开始检测。
选择两家实验室10个测量系统，每天每个实验室取W1～W4各1支，L2、U3和U4各3支，室温下复融，每个实验室每个检测系统：
W1～W4每支每天连续测3次；
L2、U3和U4每支每天测定6次，共测3支，即L2、U3和U4分别有18个测定值。
每天定值前确保每个测量系统室内质控在控后，依次对W1～W4，L2、U3和U4开始测定，测定过程中室内温湿度稳定。
6．定值运算方法：
用直线拟合的方法为正确度验证物质定值和计算定值过程的不确定度[7,8]。
用国际标准物质稀释后的理论浓度和实际测定浓度，每个系统做出一条直线。
将正确度验证物质样本测出值，计算均值代入直线方程，得出某一定值，然后把10个系统的定值结果取均值，最终得出正确度验证物质的定值，L1的定值采用U3和U4的结果计算得到。
7．定值总不确定度的评估方法：
根据ISOGuide35文件，总不确定度由候选标准物质的定值测量、均匀性、长期稳定性和测量工具如分析天平等引入的不确定度合成，计算公式：
μver2为测量不确定度，它包括了标准曲线、测定重复性和ERM－DA474的不确定度；
μbb2为不均匀性引入的不确定度；
μlts2为长期稳定性引入的不确定度，μgrav为分析天平等测量工具引入的不确定度。
k＝2，为扩展因子。
国际标准物质ERM－DA474的说明书给出的扩展不确定度是2.5mg/L，在计算中应加以考虑，但对于检定合格的天平，其引入的不确定度较小，不予考虑
三、正确度验证试应用
1．分发样本：
两个浓度水平CRP正确度验证物质，分发至北京地区46家临床实验室，每个实验室每个浓度水平各发2支。
2．运输：
运输过程中将样本放置于有冰袋的保温容器中，以保证样本处于冰冻状态。
3．测定方法和结果上报：
分别于两个工作日测定，每天测定1支，在现用检测系统连续测定3次。
测定当天将样本在室温放置30min，待其完全融化，平衡至室温后，轻轻上下颠倒10次混匀，避免产生气泡。
最后，将所有数据上报至北京市临检中心指定邮箱。
4．正确度验证数据处理：
用Excel2007软件计算每个实验室6次结果均值和标准偏差，以定值结果为靶值，以卫生部临床检验中心1/2允许总误差（1/2TEa）为允许限（12.5%），绘制正确度验证示意图；
对给予回报结果的42家实验室的均值结果采用国家标准（GBT4883－2008）Grubbs法[9]剔除离群值，采用SPSS17.0对数据进行正态性检验，最后将所有方法的均值（x1）和扩展不确定度（u1）与正确度验证物质认定值（x2）和不确定度（u2），采用效能函数（En＝，这里U1和U2分别指u1和u2，此处u1＝，s*为稳健标准差，p为参加实验室数；
u2为以上定值总不确定度），验证定值的临床适用性。
结果
一、多系统定值
1．个检测系统定值标准曲线及正确度验证物质定值：
各定值标准曲线的斜率范围为0.660～0.992，相关系数r的范围为0.999～1。
需定值的3个浓度点均在各系统的定值曲线上，见图1,图2。
图1
8个系统增强透射比浊法定值标准曲线及定值
图2
两个系统速率散射比浊法定值标准曲线及定值
2．CRP正确度验证物质多系统定值：
正确度验证物质最终定值为10系统定值的均值，定值过程中的不确定度分量取10个系统总不确定度的均值，除BeckmanImmage800由于试剂不足，仅仅进行了1d的定值，获得了18个定值数据，其他9个系统均进行了2d的定值，获得了36个定值数据（表4）。
考虑到该物质的均匀性与稳定性引入的不确定度，CRP冰冻混合人血清正确度验证物质经过ERM－DA474国际标准物质量值传递，经2家实验室，10个主流检测系统联合定值，最终定值结果为：
水平1：
（109.9±
9.4）mg/L,水平2：
（27.1±
2.4）mg/L（表5），不确定度与国际标准物质ERM－DA474（41.2±
2.5）mg/L相当。
表4
10个系统CRP正确度验证物质定值结果
表5
CRP正确度验证物质总不确定度评估及最终定值结果
二、正确度验证实验
1．正确度验证结果回报：
该物质样本共分发北京市46家实验室，42家实验室回报结果，其中三级医院30家，二级医院12家。
2．CRP正确度验证物质水平1（L1）正确度验证结果分析：
42个L1回报结果中，总体均值为114.19mg/L，标准差为19.10mg/L，稳健标准差（s*）为15.968mg/L，中位值为109.58mg/L，最大值为162.07mg/L，最小值为70.1mg/L。
根据Grubbs法，有1个离群值（33.37mg/L），剔除后的结果见图3。
经SPSS17.0Kolmogorov－SmirnovZ检验，实验室回报的L1数据成正态分布。
效能函数为0.48，小于1。
CRP项目室间质量评价允许偏差为±
25%，上下限为±
12.5%（1/2TEa）。
从图3中可以看出高于上限有8家实验室，低于下限有3家实验室，北京市有73.8%的实验室L1测定结果合格。
图3
高浓度（L1）样本CRP正确度验证结果
3．CRP正确度验证物质水平2（L2）正确度验证结果分析：
42个L2回报结果中，总体均值为26.51mg/L，标准差为3.23mg/L，稳健标准差（s*）为2.921mg/L，中位值为25.65mg/L，最大值为33.90mg/L，最小值为20.02mg/L。
根据Grubbs法，所有结果无离群值。
经SPSS17.0Kolmogorov－SmirnovZ检验，实验室回报的L2数据成正态分布。
效能函数为0.28，小于1。
从图4可以看出，高于上限有5家实验室，低于下限有5家实验室，北京市有76.1%的实验室L2测定结果合格。
图4
低浓度（L2）样本CRP正确度验证结果
4．2015年CRP正确度验证调查评价：
在可接受限内的实验室为30家，占所有回报结果的实验室的比例为71.4%（图5）。
图5
2015年CRP正确度验证调查评价结果
讨论
近年来随着许多灵敏、准确而简便的CRP检测方法的相继问世，出现较多的测定CRP的检测系统，不同检测系统测定结果可能存在差异[10,11]，如何实现检验结果的溯源性和可比性成为亟待解决的现实问题。
这也是实验室标准化、实验室认可及检验结果互认的必然要求，而基于量值溯源室间质量评价/正确度验证在这一过程中发挥重要作用[12]。
本实验所研制的两个浓度CRP正确度验证物质，已证明具有良好的均匀性，室温和2～8℃能稳定7天，－80℃至少稳定44个月，同时与患者血清具有良好的互换性，而ERM－DA474/IFCC稀释系列与患者血清也具有良好的互换性。
这为采用ERM－DA474对该正确度验证物质进行量值传递，多家实验室多个系统的联合定值提供了实验数据支持。
为正确度验证物质定值最好要基于参考方法，即通过参考方法将国际标准物质的值通过不间断溯源链，以较小的不确定度进行传递[13]。
对于没有参考方法的临床常规蛋白类检验项目，目前国际上采用靶值转移的方法[14]，我们即利用国际标准物质ERM－DA474进行量值传递，在两家实验室采用10个目前国内实验室最常用的CRP血清测定系统，用多系统联合定值的方法，最终给两个水平的CRP正确度验证物质进行定值，所获得的不确定度小（9.4和2.4mg/L）。
利用IFCC的ERM－DA474国际标准物质进行量值传递，准确配制一系列已知浓度的ERM－DA474的标准工作液是很重要的，我们首先测定了ERM－DA474及其稀释液、待定值物质各自的密度，再按照称得的质量，计算其体积和相应的物质的量，以减少实验中可能的吸样误差和不确定度[15]。
标准工作曲线的稀释液，我们采用了健康体检个体的低值血清（经两个检测系统测试均值为0.27mg/L）作为ERM－DA474的稀释液，已证明制备的正确度验证物质、ERM－DA474/IFCC稀释系列与患者血清和具有良好的互换性，所以用低值CRP人血清作为稀释液，能达到定值过程中基质效应最小化[16]，既能将国际标准物质的值准确传递，又能使国际标准物质的互换性不会改变[17]。
从而10个检测系统最终定值结果非常接近（表4）。
在定值物质的正确度验证试应用中，我们选择了北京市42家二甲以上医院的实验室，它们均有良好的室内质控和室间质评的质量管理体系，都能很好地服务于临床。
制备的2水平正确度验证物质在北京地区临床实验室的适用情况良好，两个水平的定值结果分别为（109.9±
9.4）mg/L和（27.1±
2.4）mg/L。
42家实验室测定的L1均值为114.19mg/L，标准差为19.10mg/L，L2均值为26.51mg/L，标准差为3.23mg/L。
定值结果与所有参加实验室的均值差异无统计学意义，效能函数En均小于1。
反过来也验证了本研究中定值结果的可靠性和实用性。
综上所述，针对目前国内现状，本研究研制的人血清来源的CRP正确度验证物质与国际标准物质相比，原料来源丰富。
该物质经过多个检测系统联合定值，采用国际标准物质ERM－DA474进行量值传递，不仅在常规检测系统的室间质量评价和正确度验证计划中发挥作用，提高和监测不同实验室、不同检测系统的CRP检测结果的准确性及一致性，还有望用于临床实验室常规检测方法的校准或校准验证，以及为试剂厂家工作校准品定值，将来可能产生一定的经济效益和社会效益。
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