植物细胞骨架的光学显微镜观察文档格式.docx

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4.学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有

关操作技术。

一、实验目的

掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的

结构，学会制作永久封片。

二、实验原理

当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活

性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋

白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。

当用考马斯亮蓝

R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨

架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有

关的蛋白质。

考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨

架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细

而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径

约在40nm左右。

新鲜洋葱鳞状叶。

普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，

染色板，吸水纸，擦镜纸。

五、实验药品

1．M—缓冲液：

所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／L

KCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA（乙二醇双（α—氨基乙基》醚

四乙酸），0.1mmol／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇

<

DTT）。

lmol／LHCl调pH到6.8

20.01mol/L磷酸缓冲液（pH6.8）

用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制

其中磷酸盐缓冲液配法：

0.2mol/LNa2HPO449ml

0.2mol/LNaH2PO45lml

3.1％TrltonX—100，用M—缓冲液配制。

4．0.2％考马斯亮蓝R250。

配制用的溶剂为：

甲醇：

冰醋酸:

水

（46.5：

7：

46.5）。

·

5.3％戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）配制

6.50％，70％，95％乙醇。

7.叔丁醇

8.正丁醇

9.二甲苯。

10.中性树胶。

1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH

6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。

2．吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。

3.吸去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。

4.用3％戊二醛固定0.5h。

5.再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。

6.0.2％考马斯亮蓝R250染色20—30min（在染色板上）。

7.用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜

下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。

8.如观察结果较佳，可制作永久封片：

在有样品的50ml烧杯中，

依次用如下试剂处理:

50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，（1/2）V95％乙醇

+（1/2）V叔丁醇，叔丁醇（以上每个步骤反应5—10min）或正丁醇，正丁

醇，二甲苯，二甲苯（每个步骤5—10min）。

然后，将样品置于载玻片上

展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。

叶绿体的分离与荧光观察

一、实验目的

掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优

缺点。

二、实验原理

用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它

沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组

分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。

三、实验材料

新鲜菠菜叶

四、实验器材

组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心

管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。

匀浆介质（0.25mol／L蔗糖、0.05mol／LTris—HCi缓冲液，

pH7.4）：

称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加

入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。

50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。

0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙

六、实验步骤

（一）叶绿体的密度离心

l.洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪

碎。

2.加入预冷到近0'

C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。

3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。

4.滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心

1min。

5.在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，

注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗

糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。

加液完后，

可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。

6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。

7．离心8000r／min，20min。

8.取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；

用滴管轻

轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。

还可在暗室内用荧

光显微镜观察。

（二）菠菜叶手切片观察

用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2

滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，

（1）在普通光镜下观察·

（2）在荧光显微镜下观察

（3）用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色

lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

七、实验结果

（一）叶绿体的分离和观察

1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看

到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2.以Olympus荧光显微镜为例，在选用B《blue》激发滤片、B

双向色镜和0-530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧

光。

3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混

有的细胞核则发绿色荧光。

（二）菠菜叶手切片观察

1．在普通光镜下可以看到三种细胞，

（1）表皮细胞：

为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

（2）保卫细胞：

为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

（3）叶肉细胞：

为排成栅状的长形和椭园形细胞。

叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。

2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度

要比游离叶绿体弱。

气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿

体侧环绕气孔排列成一圈。

表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞

少。

3．用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发

绿色荧光，气孔仍为绿色。

细胞组分的分离

掌握分级分离方法。

利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级

差速离心的方法，将各组分逐级分离出来。

小鼠（30克）取肝脏

同实验七外加eppendorf管、微量进样器、tip头、台式高速

冷冻离心机。

匀浆介质（0.25mol/L蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液

pH7.4），乙醇：

冰乙酸（3：

1），生理盐水，姬姆萨染液，中性红一

詹纳斯绿染液（称取0.04g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于l00ml，

0.25mol/L蔗糖溶液中）。

其中0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：

0.lmol/L三羟甲基氨

基甲烷（Tris）10ml，0.1mol/L盐酸8.4ml加蒸馏水至100ml。

六、实验步骤

1.低速离心分离细胞核

（1）将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅

速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。

，

（2）称取0.5g肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质

洗涤数次。

（3）将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。

用4层

纱布（先用少量匀浆介质湿润）过滤匀浆液至Corex离心管中，同时制

备l张滤液涂片，做好标记，自然干燥。

（4漓心机上500r／min离心5min（4℃），将上层溶液吸入2支

eppendof管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。

沉淀物作进一步处理。

（5）用5ml匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以

1000r／min离心10min（4℃），吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀

物上层涂片。

剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml匀浆介质，

用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记，自然干燥。

2.高速离心分离线粒体

（1）将步骤l（4）中的eppendof管在台式高速冷冻离心机上以

10000r／min离心5min，缓缓吸出上清液至另2eppendorf管，留

取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。

（2）另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r／min离心

5min。

（3）吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。

3．分离物的鉴定

（1）细胞核。

将步骤l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定

15min，吹干，滴姬姆萨染液（原液用1／15mol磷酸缓冲液

稀释10—20倍）染色10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜

下比较观察涂片。

（2）线粒体。

在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红—詹纳斯

绿染液，取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片

上，染色30min后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。

附：

更精致的分离方案

将4.5ml0.34mol／L蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入

4.5ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。

用高速冷冻离心机以700×

g离心

10min，得上清液I和沉淀物。

沉淀物用10ml0.25mol／L蔗糖溶液洗2

次，每次1000×

g离心10min，得到的沉淀物可进行以下处理。

（1）收集

质膜：

吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中，沿

管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层，经700

×

g离心10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。

（2）细胞

核纯化：

将沉淀用5倍体积的0.34mol／L蔗糖0.5mol／LMg（Ac）2溶

液混悬，铺在4倍于核悬液体积的0.88m01'

／L蔗糖—0.5mol／L

Mg（Ac）2溶液之上，1500×

g离心20min，沉淀物即为纯化的细胞核。

（3）分离核仁：

纯化的细胞核混悬在2倍体积的0.34mol／L蔗糖—

0.5mol／LMg（Ac）2溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质

pH中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于4倍体积的

0.88mol／L蔗糖—0.5moI／LMg（Ac）2溶液之上，1700×

g离心17min。

沉淀物即为核仁，溶液为上清液I。

将上清液I10000×

g离心lOmin得上清液Ⅱ和沉淀物，沉淀物以

lOml预冷的0.25mol／L蔗糖溶液洗2次，每次10000×

g离心10min，

得沉淀物即为纯化的线粒体。

上清液Ⅱ经16300×

g离心20min得上清液Ⅲ和沉淀物，沉淀物

以lOml预冷的0.25m01／L蔗糖溶液洗；

16300×

g离心20min，得沉淀

物即为纯化的溶酶体。

上清液Ⅲ经100000Xg离~~'

30min，得沉淀物（为微粒体）和上清

液Ⅳ，后者再经离心150000×

g3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分

子等。

四膜虫纤毛的再生

一、背景和原理

纤毛和鞭毛是细胞表面的特化结构，具有运动功能。

纤毛和鞭毛的结构基本相同。

纤毛轴心含有一束“9＋2”排列的平行微管，中央微管均为完全微管，外围二联体微管由A，B亚纤维组成，A亚纤维为完全微管，由13个球形亚基环绕而成，B亚纤维仅由10个亚基构成，另3个亚基与A亚纤维共用（图9-16）。

微管是由微管蛋白组成的管状结构，对低温、高压和秋水仙素敏感。

大多数微管纤维处于动态的组装和去组装状态，这是实现其功能所必需的过程。

本实验以Rosenbaum和Carlson（1969）的实验为基础，在降低pH和钙离子存在的条件下通过机械修剪的方法，在膜水平脱去四膜虫的纤毛，剩下肿胀的，不能运动的细胞。

在不同的生长温度（25℃和17℃）下观察纤毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微管亚单位的合成和组装。

二、实验目的

1．使用相差显微镜和血球计数器；

2．了解微管组装的基本原理

三、教学安排

学时数：

3－4小时。

四、实验仪器、器材与试剂

1．材料：

梨形四膜虫。

2．仪器：

锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm膜，载玻片，盖玻片，定时器。

3．试剂：

蛋白胨，亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA，醋酸钠，氯化钙。

五、实验方法与步骤

1、分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25℃和17℃培养。

（时间）

2、两瓶培养物分别800g离心10分钟，重新悬浮于15毫升1%蛋白胨溶液，置于50毫升锥形瓶，做好标记。

3、准备2个50毫升锥形瓶，各加入15毫升1%蛋白胨溶液；

3个100毫升锥形瓶，含20毫升1%蛋白胨溶液，分别加入10微克/升亚胺环己酮；

50微克/升亚新霉素；

加入2毫克/升秋水仙碱。

4、以下操作在冰浴上进行：

1）在零时间，用一个大试管在冰浴上将2.5毫升浓缩的四膜虫悬液（生长于25℃）加至5毫升介质A（10mMEDTA·

2Na;

50mM醋酸钠；

pH6.0）中，搅拌混匀。

2）30秒后加入2.5毫升预冷的蒸馏水。

3）1分钟后加入0.25毫升预冷的0.2McaCl2,parafilm膜封口，倒转试管使之混合。

4）2分钟后用装有19号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中（修剪掉四膜虫的纤毛）。

迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。

5）去纤毛后，立即把1毫升去纤毛的细胞加至20毫升1%蛋白胨溶液，25℃预热的100毫升锥形瓶中，于25℃培养并开始实验。

5、每隔10分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性（motility）%进行分析。

由于脱纤毛的细胞不能运动，切记在取样前振荡锥形瓶。

在血细胞计数器上观察，估计运动细胞和非运动细胞的数目。

制备快速标本，在相差显微镜下观察细胞是否肿胀，有无新生纤毛等情况。

6、同时对生长于17℃的四膜虫进行脱纤毛，并同在25℃的四膜虫的纤毛再生时间比较。

7、从生长于25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。

每隔10分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。

8、从生长于17℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱纤毛细胞。

9、从生长于25℃的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。

对下列各个瓶中分别加入1ml脱纤毛细胞：

（i）蛋白胨＋10µ

g/ml亚胺环己酮

（ii）蛋白胨＋50µ

g/ml新霉素

（iii）蛋白胨＋2mg/ml秋水仙碱

（iv）只含蛋白胨作为对照

每隔10分钟从瓶中取样。

让实验进行尽可能长的时间，以便观察其反应是否发生改变。

记录结果

实验结果以能动性（％）对时间（min）作图表示：

（1）生长于25℃和17℃的四膜虫；

（2）抑制物对纤毛再生的效应。

讨论

作为这一实验的引伸，还可以应用更多的抑制物来表明，是否需要生成新的信息性分子，细胞周期中的不同时相是否起重要作用？

对抑制物的观察可以时可逆的，因为经过一个时间阶段后，细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。

这些实验着眼于纤毛的再生系统，在这些系统中很容易辨认出重点。

这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提供资料。

六、实验提示与注意事项

1.梨形四膜虫的纯培养可培养于1％蛋白胨（1％蛋白胨；

0.25％酵母浸膏），培养液用15磅/时2高压灭菌15分钟。

在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术，但在课堂实验时无需应用无菌采样技术。

为了获得实验所需数量的培养物，含250ml蛋白胨的500ml锥形瓶在25℃可培养1－2天，而在17℃需2－3天。

这一体积的培养物可用来接种25瓶新的250ml培养物。

2．生长的温度很重要；

如果四膜虫没有在25℃生长至少6天的话，则再生速率显著延缓。

因此，对两种不同生长温度的比较，形成了本实验中一部分的基础。

3.四膜虫的离心必须小心，因为在减速时细胞容易被漩涡卷起。

如果参加实验的学生较多，或没有经验，最好在实验时由一位技术员来离心细胞。

通常800g即可，但也可用1000g。

七、思考题

纤毛再生所需的时间，是包括微管蛋白的合成和组装在内的许多过程决定的。

培养物原先生长的温度为什么能影响纤毛再生率？

通过抑制物的实验结果，我们能否确定在实验过程中，纤毛再生取决于现存前体库的大小和新蛋白质合成的程度？

在较低级的真核细胞中我们能学到什么有关蛋白质合成的知识？

八、推荐阅读

Rosenbaum,J.L.andCarlson,K.1968CiliaRegenerationinTetrahymenaanditsInhibitionbyColchicine,J.cellBiol.,40,415

Rosenbaum,J.L.andChild,F.M1967FlagellarRegenerationinProtozoanFlagellates,J.CellBiol.,34,345

Rosenbaum,J.L.,Moulder,J.E.andRingo,D.L.1969FlagellarElongationandShorteninginChlamydomonas,J.CellBiol,41,600

植物愈伤组织诱发培养

掌握无菌操作进行愈伤组织诱发培养的方法。

植物组织培养和细胞培养是进行植物细胞工程的基础工作。

一般

认为，分化了的植物根、茎、叶细胞具有全能性，在一定条件下进行离体

培养，给予合适的营养条件和激素水平，可以脱分化为愈伤组织。

利用

愈伤组织可以进行一些生物化学、发育学、遗传学等方面的研究工作，

例如愈伤组织能进一步诱导分化成完整的植株，还可以将愈伤组织进

行单细胞分离，做悬浮培养，筛选各种生化突变型。

烟草或迎春花茎段

四、实验器材

培养皿，烧杯，镊子，剪刀，小三角烧瓶，大三角烧瓶，酒精灯，酒精

棉花，滴管，试剂瓶，滤纸，锡箔纸，超净工作台，植物细胞培养室。

五：

实验药品

MS固体培养基（见附录，加0．8%琼脂）：

①培养基中加生

长素2.4－D，为脱分化培养基，②培养基中加细胞分裂素6一BA

和生长素NAA，为分化培养基，①和②其它成分相同。

70％乙醇，

漂白粉溶液（1片漂白粉片／加300ml水），无菌水。

六：

实验步骤

1．培养基的配制：

MS固体培养基灭菌后稍冷，倒入无菌

培养皿分装，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二层牛皮

纸盖上用绳扎紧，灭菌后待用。

2．迎春花枝条，去叶，用水洗茎。

洗干净后剪取5cm长的

枝条3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。

再转入漂白粉

溶液，消毒lmin。

3．移入超净台，按无菌操作要求将茎段取出置于无菌培养

皿内，用无菌水反复冲洗。

再用无菌镊子移入另一培养

皿内，再用无菌水反复冲洗。

4．将茎段剪小，每段约lcm长，放入脱分化培养基，每皿

6—7段，均匀分散在培养皿中，26℃暗培养3—4天，观

察有无染菌。

5．挑取无污染茎段，转接入新的脱分化培养基，继续暗培

养7天，可观察到愈伤组织开始生长。

6．如果以无菌烟草为材料，可跳过2、3两步，省去消毒、

漂洗过程。

直接进入第5步。

取烟草叶片进培养。

培养7天检查有无染菌，如有污染再转接一次，继续

暗培养7天，在这阶段可以看到叶片细胞脱分化产生愈

伤组织。

7．将烟草愈伤组织转接到细胞分化培养基，照光培养2—

3周，可以观察到细胞分化产生新的苗。

鼠肾细胞原代培养

了解细胞原代培养的原理和方法，学习细胞消化、细胞计

数、营养液的配制等操作技术，观察原代细胞的形态。

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的器官组织，经消

化，培养成为单个细胞的过程。

用胰蛋白酶对组织进行消化获得单

细胞悬液，由细胞悬液定量接种后获得原代细胞培养物。

胰蛋白酶

的作用是消化除去细胞间质，蛋白酶液中可添加胶原酶以增加消化

能力。

细胞培养是探索细胞生命活动规律一种基本的、十分有效的

实验技术，通过细胞培养可以进行细胞的结构，细胞的生长发育等

等各项研究，目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。

出生后一周左右的乳鼠。

细胞培养箱，离心机，超净工作台。

细胞培养皿，滴管，

血球计数板，吸液器，眼科剪刀，镊子，小离心管。

RPMl640培养液，小牛血