不同水体中微生物的分离与鉴定Word下载.docx

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本实验主要采用牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基对所采样本的微生物进行培养。

根据平板培养基上的菌落形态大致辨别菌属，挑去其中一部分优势菌落进行分离纯化培养。

确保无杂菌生长的条件下，从平板培养基上的菌落形态特征，革兰氏反应以及生理生化反应鉴定该菌的属性。

2.分离与鉴定原理

微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。

不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。

，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。

因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

细菌的培养特征包括以下内容：

在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。

在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。

半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

3.各类微生物的菌落特征

微生物类别

菌落特征

单细胞微生物

菌丝状微生物

细菌

酵母菌

放线菌

霉菌

主要特征

细胞

形态特征

小而均匀、

个别有芽孢

大而分化

细而均匀

粗而分化

相互关系

单个分散或按一定方式排列

单个分散或

假丝状

丝状交织

菌落

含水情况

很湿或较湿

较湿

干燥或较干燥

干燥

外观特征

小而突起

或大而平坦

大而突起

小而紧密

大而疏松

或大而致密

参考特征

菌落透明度

透明或稍透明

稍透明

不透明

菌落与培养基结合度

不结合

牢固结合

较牢固结合

菌落的颜色

多样

单调

十分多样

菌落正反面颜色差别

相同

一般不同

细胞生长速度

一般很快

较快

慢

一般较快

气味

一般有臭味

多带酒香

常有泥腥味

霉味

4.革兰氏染色原理

G＋菌：

细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：

肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

三、实验材料与仪器

1．实验材料与试剂

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、土豆、葡萄糖、草酸结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红染液

2．实验仪器

烧杯、玻璃棒、电子天平、PH试纸、电磁炉、试管、锥形瓶、封口膜、报纸、标签纸、漏斗、纱布、锅、橡皮筋、高压蒸汽灭菌锅、培养皿、酒精灯、无菌玻璃涂棒、37℃恒温培养箱、24℃恒温培养箱、镊子、接种环、移液枪、无菌操作台、胶头滴管、显微镜

四、实验步骤

5.涂布培养

1）培养基的制作

1　牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏蛋白胨培养基的配方：

牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15—20g、水1000ml、pH7．4—7．6（7.0—8.0）

✧称量

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

✧溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在电磁炉上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

✧调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。

反之，则用1mol/LHCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

✧分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

✧加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上包上封口膜，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

✧包扎

加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在封口膜外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿封口膜，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

三角烧瓶加塞后，外包报纸，用麻绳以活结形式扎好，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

2　PDA培养基

PDA培养基的配方：

土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。

✧称量和熬煮

药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。

土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。

滤液补充水分到1000ml。

✧加热溶解

把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

✧分装

将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。

分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：

固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；

半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。

✧加封口膜

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上包上封口膜或塞上塞子，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

✧包扎

加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿瓶口，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

2）灭菌

将所制作的培养基进行高压蒸汽灭菌，条件为0.1Mpa，121.℃，灭菌20分钟，冷却保存备用。

3）采样

2013年3月19号上午8:

00在浙江农林大学东湖校区附近的小鱼塘里取水150ml。

2013年3月19号下午2:

00——4:

00的雨水在浙江农林大学东湖校区收集雨水150ml.

4）倒平板

将牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基加热融化待冷却至55~60℃时，分别倒平板，每种培养基倒8皿，每个皿中培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面，待冷却凝固。

5）涂布　　　

将上述每种培养基的4个平板底面分别用记号笔做上标记，然后用无菌吸管分别从各个试管中吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基中央的位置。

右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀，室温下静止5~10min，使菌液侵入培养基。

6）培养　　　

将牛肉膏蛋白胨培养基倒置于37℃恒温箱中培养24h.

将PDA培养基倒置于24℃恒温培养箱中培养3天.

7）挑菌落

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌种接种到上述两种培养基斜面上，置于37℃恒温箱中培养，若发现有杂菌，还需进行一次分离、纯化、直到获得纯培养。

6.平板划线分离

8）倒平板

按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔表明培养基名称、水样编号和实验日期。

（PDA培养皿与牛肉膏蛋白胨培养皿各10个）

9）划线

在近火炎处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑去上述的培养基上的菌落在平板上划线，使之形成单个菌落。

用接种环一无菌操作挑取菌悬液一环，现在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约70°

角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分分别作第二次平行划线，在用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分做第四次划线，划线完毕，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

10）挑菌落

同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

7.微生物鉴定

11）菌落特征鉴定

观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。

根据菌落特征，初步判断所属真菌或细菌的类型。

12）微生物形态的观察

1　涂片：

在洁净无油污的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种按无菌操作要求挑取少量军体育水滴混合，涂成极薄的菌膜。

2　干燥：

让涂片自然干燥，也可将涂面朝上在酒精灯高出稍稍加热，使其干燥。

3　固定：

目的是杀死细菌，使菌体粘附于载玻片上，同时增加菌体对染料的亲和力。

如果干燥用加热干燥，固定与干燥可合为一步：

手执载玻片一端，涂面朝上，在酒精灯上快速通过三次

4　染色：

将载玻片置于水平面上，在整个涂面上滴加石碳酸复红或草酸结晶紫染液，染色1min左右。

5　水洗：

染色时间到，倾去染液，用自来水细流冲洗至流水无染料颜色为止

6　干燥：

用吸水纸吸去玻片上的水。

7　镜检：

用低倍镜找到标本后油镜观察，记录其形态图。

13）细菌的革兰氏染色

取一洁净的载玻片，用笔在载玻片的左右两侧注上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，用接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥，固定。

2　初染：

将涂片置于水平位置上，在两个面上滴加草酸铵结晶紫染液，染色1min，倾去染液，水洗至洗出液为无色。

3　媒染：

用新配的路哥氏碘液冲去涂面上的残水，再用路哥氏碘液覆盖涂面1min，水洗。

4　脱色：

载玻片反面衬一张白纸，手执载玻片使之倾斜，滴加95%乙醇进行脱色，当载玻片上流出的乙醇液中紫色接近消失时，立即用自来水细流冲洗，终止脱色。

5　复染：

甩去玻片上的水珠，在涂面上滴加番红染色液，染色2~3min，水洗，用吸水纸吸干。

6　镜检：

用油镜观察革兰氏染色后的菌体。

五、实验数据

1．菌落特征表

种类

鱼塘-牛肉膏、蛋白胨

鱼塘-PDA

雨水-牛肉膏、蛋白胨

雨水-PDA

小而突起或大而平坦

颜色

紫色，白色

白色

与培养基结合度

含水量

很湿

透明度

表明粗糙/光滑

光滑

有臭味

2．微生物个体形态特征与革兰氏染色记录表

样品名称

微生物种类

形态

图示

革兰氏染色

鱼塘水（PDA培养基）

棒杆状

紫色

鱼塘水（牛肉膏蛋白胨培养基）

链球装

橙红色

雨水（PDA培养基）

杆状

雨水（牛肉膏蛋白胨培养基）

六、实验结果

经我们的分离鉴定鱼塘中的微生物种类主要是棒杆状的革兰氏阳性细菌和链球状的革兰氏阴性细菌，雨水中的微生物种类主要为杆状的革兰氏阳性细菌，但由于缺少生理生化实验，并没有明确知道它们所属的门。

七、实验结果的讨论分析

从两份水样中筛选分离出30株细菌菌落，其中棒杆状的革兰氏阳性细菌占35%，链球状的革兰氏阴性细菌占10%，杆状的革兰氏阳性菌占30%，还有一部分的菌落由于划线分离不彻底，导致菌落的形态特征不明显且有杂菌生长的现象，菌落特征均为细菌，没有明显的真菌生长的现象。

可能是实验过程中没有经过多次分离，得到的单菌落可能还不太纯，所以在镜检中出现多种形态，但还是能观察到主要的单菌落。

如若时间允许，还应进行多次分离过程，得到更精确的结果。

水体的种类不同，其中所含的微生物种类也会有较大的区别。

鱼塘水中的微生物以革兰氏阴性杆菌占较大的优势，因为陆地上微生物冲洗污染的原因，其中多数来自人类和其他温血动物的排泄物污染，在鱼塘水中常见的致病细菌包括：

沙门氏菌，大肠杆菌，霍乱弧菌等等，但要确定我们分离出的菌落中是否含有这些致病菌，还得进一步做生理生化实验进行鉴定。

而雨水的微生物，除却其凝结核上所携带的微生物以外，还可能携带空气中的微生物，从雨水的水样中分离出的细菌菌落，相较于鱼塘水简单，鱼塘水的生境受生物的影响较大，生态系统更为复杂。

鱼塘水中分离出来的细菌种类可能和养殖在其中的水体动物有关，如藻类，鱼类等等。

通过对两种水样中微生物的分离，我们还可以可以对我们生活的环境有一个初步的了解。

细菌对生存条件的要求很低，其在各种环境条件下都有可能大量繁殖，进一步影响生物的生存环境。

原本的实验设计预期在PDA培养基上可能会有真菌的生长，但最终没有，原因可能是在培养过程中，细菌数量过于庞大，导致真菌无法生长，也可能是划线分离时，忽略了真菌的菌落，导致没有得到真菌的单个菌落。

八、实验心得体会

本实验使我们初步了解微生物从环境中分离和鉴定的基本过程，提高了我们应用知识的能力和技能。

我们掌握了查阅文献、阅读整理文献的方法，提高了进行综合分析、解决实际问题及动手操作的能力。

培养了我们创新意识和创新精神，增强了团队之间的协作意识。

同时，我们进一步熟悉微生物分离培养与鉴定的操作步骤。

———————————————雷拴红

在整个实验过程中，我们也遇到了不少的困难，像是样品材料的收集地点无法确定、灭菌的培养基中长杂菌、划线分离培养没有培养出单个的菌落、甚至是在分离纯化的过程中出现大面积的杂菌污染，但是最终解决并顺利完成实验。

这是一次完全独立自主操作的实验，也是一次很有效的学习过程。

——————————————————————————金燕南

做微生物实验是个非常精细的活动，每个步骤不管是配培养基、到平板、接种、划线、鉴定都要严谨的操作，严格无菌操作，遵守每一步的操作步骤，不能心急要一步一步耐心操作，不然很有可能得不到自己要的实验结果，比如我们第一次实验时操作不当，得不到可分离的单菌落。

而且，我觉得做事之前要做好规划，多做一手准备，因为我们第一次实验失败，需要重新配培养基与灭菌，浪费了许多时间。

还有就是小组之间的分工合作很重要，不管是现在在校学习，还是将来出社会工作，合作能很好的提高工作效率。

——————————————————————————徐依疑

从实验开始到最后的汇总报告，我想我们学到的最重要的应该就是团队合作的重要性。

在整个实验过程中我们各司其职，有条不紊的进行实验，虽然在这过程中我们遇到了很多问题，也遇到了不懂不会的地方，但是最后总能克服它。

对于合作的认知远大于对实验本身的认知，这就是我学到的知识，从书本上学不来，老师也教不来，获益匪浅，受益一生。

-----何叶

附件一各组员实验过程分工

徐依疑：

实验资料的收集与整理、数据记录、具体实验操作

何 

叶：

样品的采集、总结汇报、具体实验操作

雷拴红：

实验报告整理完善、具体实验操作

金燕南：

实验资料的收集与整理、ppt制作、具体实验操作

李建宏：

具体实验操作

附件二实验过程安排表

日期

内容

备注

3、14

星期三

确定实验内容

3、18

星期一

配培养基

牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基

3、19

星期二

采样

校外公路旁的鱼塘水和雨水

3、20

培养基异常，重新配培养基

没有及时灭菌，感染杂菌

3、21

星期四

倒平板，涂布接种

3、25

画线分离，培养

分别在合适的温度下进行培养

3、28

分离异常，重配培养基

分离不彻底，培养基用完

3、29

星期五

重新画线分离

4、1

革兰氏染色鉴定、细菌形态鉴定

参考文献

[1]李梅姿.中国湖泊水库环境调查研究.北京:

中国环境科学出版社,1990.158～161

[2]陈绍铭,郑福寿.水生生物学实验法.北京:

海洋出版社,1985

[3]汪富三,陈士怡.杭州西湖水体异养细菌的调查研究.杭州大学学报,1983,10（supp）:

65～74

[4]沃尔克.中国科学院南京土壤研究所微生物室译.土壤微生物学.北京:

科学出版社,1981

[5]许光辉,郑洪元.土壤微生物分析方法手册.北京:

农业出版社,1986.131～133

[6]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法.北京:

科学出版社,1978

[7]许光辉,李振高.微生物生态学.南京:

东南大学出版社,1991.149～189