gfp基因的克隆与表达Word下载.docx

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121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；

溶液Ⅱ100mL

NaOH

0.2mol/L

SDS

1%（W/V）

用时由母液2mol/LNaOH、10%（W/V）SDS稀释现配；

溶液Ⅲ100mL

KOAc（5mol/L）

60mL

冰乙酸

11.5mL

H2O

28.5mL

121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；

氯仿；

琼脂糖；

灭菌的去离子水；

10×

酶切缓冲液；

TaqDNA聚合酶；

TaqDNA聚合酶缓冲。

灭菌的0.1mol/LCaCl2，标准相对分子质量的DNA；

溴乙锭（EB）储存液0.5µ

g/mL；

LB/Kan（50µ

g/mL）固体培养基；

IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用；

卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用；

70%乙醇：

用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4℃；

无水乙醇：

放在0~4℃；

RNase母液：

将RNase溶于10mmol/LTris·

Cl（pH7.5）、15mmol/LNaCl配成的试剂中，配成10mg/mL的溶液，在100℃加热15min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃；

1.2方法：

1.2.1大肠杆菌DH-5α（pEGFP-N3）染色体DNA的提取

1.2.2、实验目的：

掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。

1.2.3，器材：

⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱

⑵，消化缓冲液:

CTAB/NaCl溶液：

4.1g 

NaCl溶解于80ml 

H2 

O,缓慢加入10g 

CTAB,加水至100ml；

其它试剂：

氯仿:

异戊醇（24:

1），酚:

异戊醇（25:

24:

1），异丙醇，70% 

乙醇，TE，10% 

SDS，蛋白酶 

K 

（20mg/ml或粉剂），5mol/L 

NaCl。

1.2.4实验原理

生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。

DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。

苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。

经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。

DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。

1.2.5、实验步骤1. 

100ml 

细菌过夜培养液, 

5000rpm离心10分钟, 

去上清液。

2. 

加9.5ml 

TE悬浮沉淀, 

并加0.5ml 

10% 

SDS, 

50μl 

20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶 

K, 

混匀, 

37℃保温1小时。

3. 

加1.5ml 

5mol/L 

NaCl, 

混匀。

4. 

CTAB/NaCl溶液, 

65℃保温20分钟。

5. 

用等体积酚:

1）抽提, 

将上清液移至干净离心管。

6. 

用等体积氯仿:

取上清液移至干净管中。

7、加 

1/10 

体积3mol/L 

NaAc，及２.５ 

倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。

－２０℃沉淀３０min。

12000rpm15min，弃上清

8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。

9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。

10、加３０ulTE或ddH2O溶解ＤＮＡ。

11、琼脂糖凝胶电泳检测

注意，实验室中一般用的1.5ml的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。

DH-5α（pET-28a）的载体质粒也可根据同样方法提取。

1.3.1ＰＣＲ扩增

1.3.2实验目的

１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。

２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。

３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。

1.3.3实验原理

１、聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）：

利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。

２、ＰＣＲ反应体系

　　引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。

３、ＰＣＲ循环参数

①9５℃5min

②9５℃30s

③5２℃30s

④72℃30s

⑤goto②２９times

⑥72℃10min

1.3.4器材

1，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统

2，TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液

3，引物：

1.3.5实验步骤

１、在0.2mlPCR微量离心管中配制30ul反应体系。

　ddwater　　　　　　　　10.5ul

10×

PCRbuffer（不含MgCl2）　　　　　　　3ul

25mMMgCl2　　　　　　　2ul

10mmol/LdNTP　　　　　　　　　1ul

10μmol/L引物1　　　　　　　　1ul

10μmol/L引物2　　　　　　　　1ul

模板　　　　　　　　　　　　　1ul

　Taq酶　　　　　　　　　　　　　0.5ul

总体积　　　　　　　　　　　20ul

２、在离心机中混匀。

３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。

４、PCR结束后，取3ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测

1.4凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接

1.4.1、实验目的

1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。

2.掌握DNA体外连接的方法。

1.4.2，实验原理

1，DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：

DNA分子大小

DNA分子构象

琼脂糖凝胶浓度

电泳所用电压

电泳缓冲液

2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。

3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。

1.4.3，仪器

1，凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5mlEP管，1.5mlEP管架，65℃水浴锅

2，PCR产物，1×

TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000marker

1.4.4，实验步骤

1，2%琼脂糖凝胶电泳

2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量

3，加入5个凝胶体积量的DR-ⅠBuffer

4，混匀65℃加热融化凝胶块

5，加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积的DR-ⅡBuffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇

6，将上述溶液short后转移至spincoloumn中12000rpm,1min弃滤液

7，加入500ulRinseA12000rpm30s弃滤液

8，加入700ulRinseB12000rpm30s弃滤液

9，同8

10，将spincoloumn安置于新的1.5mlEP管中在spincoloumn膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min12000rpm1min保存1.5mlEP管1%胶检测

11，链接反应（冰上操作）

在一支0.2mlEP管中加入以下试剂：

纯化的目的DNA片段4.5ul

Vector0.5ul

连接液5ul

混匀16℃连接过夜

1.5DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

1）将0~4℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。

2）将分别接种过夜菌：

LB按1:

50的比例接种于2mL的LB液体培养基中，37℃活化培养2～3h至OD=0.3～0.5。

3）取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。

弃上清液，沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30min后，4℃下5000r/min离心10min。

4）弃上清液，沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20℃冰箱内保存。

1.6感受态细胞的转化

1）取制备好的感受态细胞100μl，冰上解冻，均匀悬浮。

2）加入2μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30min。

3）42℃水浴中热击70sec后，冰上放置2min。

4）加入200μlLB液体培养基，37℃，50-100rpm振荡培养1h。

5）取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。

1.7碱法提质粒

1）用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于2mL含有抗生素的LB液体培养基中，37℃,180r/min振荡培养过夜。

2）取1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、11000r/min离心1分钟，吸弃上清。

3）向离心管中加入150l用冰预冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重悬沉淀。

4）加入200l新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，冰上放置5分钟。

5）加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置3~5分钟。

6）用微量离心机于4℃、11000r/min离心5分钟，吸取上清转移到另一离心管。

7）加等体积氯仿400l抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、11000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

8）吸取上清液300l，向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；

用微量离心机于4℃、11000rpm离心5分钟，弃上清。

9）用70%乙醇洗涤2次，再次4℃、11000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥。

向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA，加入2l10mg/mlRNA酶，37℃处理1小时后于-20℃贮存。

1.8酶切鉴定

1）取提取的质粒8l于另一微量离心管中，加入2lBamHI和NotI的酶切混合液，轻弹管外混匀反应物。

2）离心，使溶液聚集在管底部。

3）37℃，酶切反应。

1.9琼脂糖凝胶电泳

1）称取0.8g琼脂糖，放入到锥形瓶中，加入100mL1×

TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全融化，冷却至60℃左右。

2）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

3）将胶板除去封胶带，加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米，轻轻拔除梳子。

4）吸取10l的质粒与2l的上样液混匀，吸取混合液将加入加样孔。

5）接通电泳槽与电泳仪的电源，设置电泳数据U=100V,I=30mA。

6）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

7）在凝胶成像分析系统中观察结果。

2.0PCR-聚合酶链式反应

1）将PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反应体系各成分

PCR反应体系

各成分的量

模板DNA

0.1l

P1（20mM）

0.2l

P2（20mM）

dNTPs（10mM）

0.4l

Taq酶（5U/l）

PCRbuffer

2l

ddH2O

16.9l

Total

20l

2）将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。

预变性95℃3min，变性95℃30s，退火60-55℃30s，延伸72℃1min10个循环，每个循环降0.5℃。

变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20个循环，72℃延伸2min。

3）PCR扩增完毕后，取出PCP管放在冰盒上。

4）取8l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。

2.1pET-28a-GFP重组质粒转化到表达菌BL-21

1）取100μl感受态BL-21，冰上慢速解冻，均匀悬浮。

加入2μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP，轻轻混匀，冰上静置10-30min。

2）42℃水浴热激70s，冰上放置2min。

3）加入200μl含抗生素的LB液体培养基，37℃，60r/min震荡培养30min。

四支EP管中加入0.5μl的100mM的IPTG诱导，另外EP管中不加入IPTG诱导。

4）吸取200μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培养倒置12-16h。

2.2重组绿色荧光蛋白（GFP）的诱导表达

1）取GFP重组菌接种于2mlLB培养液（含Kana100mg/l）中，37℃150-220r/min过夜培养。

2）将20μl菌液按1：

50—100接种于2mlLB培养液（含Kana100mg/l）中，37℃200r/min培养2h。

3）按IPTG:

LB培养基按1:

1000加入2μl的IPTG诱导表达，继续培养，对照组不加IPTG诱导。

4）用紫外线照射菌体沉淀，保存照片。