茶多糖提取工艺的优化Word文档格式.docx
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茶多糖是茶叶中极具开发价值的一种生理活性物质，现代药理学研究表明茶多糖具有降血糖[1]、降血脂[2-3]、降血压、减慢心率、增加冠脉流量[4]、抗氧化[5-6]、抗凝血[7]等作用，近年来发现茶多糖还具有治疗糖尿病的功效[8-9]。
茶多糖提取工艺的研究对于茶多糖的提取率高低都有重要意义。
苏永昌[10]对乌龙茶多糖的提取工艺进行了研究，得到最佳的提取工艺条件：
料液比1︰1，浸提温度100°
C，浸提时间3h，沉淀剂量为3倍体积丙酮；
周小玲[11]对茶多糖进行了定量、定性及生物活性研究，表明绿茶中的茶多糖（TPS）具有很大的潜力开发为一种降血糖、降胆固醇的功能食品成分，具有广阔的应用前景；
曹鹏飞[12]等运用正交试验设计优选茶多糖的提取工艺，得到最佳提取条件为：
料液比1︰10，浸提时间为60min，浸提温度为100°
C，沉淀时所用的乙醇浓度为75%。
本文采用先水提后醇沉的方法分离提取茶叶中粗多糖，重点探讨了pH值单因素对茶多糖提取率的影响以及在正交试验条件下对茶多糖提取率的影响，再采用苯酚-硫酸法对茶多糖进行含量测定[13-14]，通过正交试验设计[15]，得到茶多糖提取的最佳工艺条件，为合理开发利用茶叶资源提供了理论依据。
2实验部分
2.1材料与仪器
2.1.1材料与试剂
无水乙醇、葡萄糖、5%苯酚、浓硫酸、蒸馏水等试验中所用化学试剂均为分析纯；
配制45%、55%、65%、75%、85%、95%浓度的乙醇溶液；
配制pH值为2、4的盐酸溶液；
配制pH值为10、12的氢氧化钠溶液；
通山眉茶（咸宁市茶叶市场提供）
2.1.2仪器
研钵、烧杯、玻棒、温度计、布氏漏斗、抽滤瓶、量筒（100ml）、胶头滴管、带刻度的试管、离心胶管、量杯（100ml）、容量瓶（10ml、50ml、100ml、250ml）、吸液管（1ml、5ml、10ml）
电子天平：
FA1004型，上海良平仪器仪表有限公司
尼龙分样筛：
60目，上海锦联丝网经营部
真空干燥箱：
DZF-6020型，上海精宏实验设备有限公司
调温电热套：
KDM型，山东省鄄城永兴仪器厂
旋转蒸发仪：
RE-5299，巩义市英峪予华仪器厂
循环水式真空泵：
SHZ-D（
），巩义市予华仪器有限责任公司
低速自动平衡离心机：
LDZ4-0.8，北京医用离心机厂
紫外可见分光光度计：
UV-1700型，SHIMADZU（日本岛津）
2.2茶多糖的提取方法
2.2.1茶叶的预处理
将干燥的茶叶放入研磨中碾磨、过筛，再碾磨再过筛，得到茶渣与粉末分别放入烧杯中备用。
2.2.2茶多糖的提取
2.2.2.1工艺路线：
取20g茶叶—研磨、过筛（重复几次）—水浸提（控制浸提条件）—然后抽滤—取滤液—滤渣（再浸提一次）—合并滤液—于旋转蒸发仪—减压蒸发浓缩至原体积的20%—稍冷—加入一定浓度的乙醇—于离心机中离心分离（3000r/min、30min）—弃去上清液—得到沉淀物—洗涤、烘干—称重并计算提取率。
2.2.2.2操作步骤：
称取烘干后的茶叶，分别在设定条件下浸提，抽滤除去沉淀，重复2次，合并提取液，按照2.2.2.1工艺路线操作，主要操作步骤如下：
减压浓缩：
将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，水浴温度为60°
C。
乙醇沉淀：
在强烈搅拌的状态下向浓缩后的提取物中缓慢加入4倍体积一定浓度的乙醇，其间有絮状沉淀产生，静置10min。
离心分离：
将静置后的醇沉淀液中的絮状沉淀分离出来，转速3000r/min，离心时间30min，完毕之后用95%乙醇洗涤沉淀3次。
烘干：
在温度为80°
C的鼓风干燥箱中烘干。
2.3茶多糖提取工艺条件的研究
2.3.1单因素实验
试验选择pH值、浸提温度、浸提时间以及乙醇的浓度作为单因素实验，进行茶多糖提取率影响因子的分析。
选择浸提温度为55°
C、浸提时间1.5h、乙醇浓度75%条件下，分别在pH值为2、4、7、10、12下，进行茶多糖的提取；
选择pH值为7、浸提时间1.5h、乙醇浓度75%条件下，分别在浸提温度为35°
C、45°
C、55°
C、65°
C、75°
C、85°
C、95°
C下，进行茶多糖的提取；
选择pH值为7、浸提温度55°
C、乙醇浓度75%条件下，分别在浸提时间0.5h、1h、1.5h、3h、4h、5h下，进行茶多糖的提取；
C、浸提时间1.5h条件下，分别在乙醇浓度为45%、55%、65%、75%、85%、95%下，进行茶多糖的提取。
2.3.2正交实验设计
根据单因素实验结果，选择pH值、浸提温度、浸提时间以及乙醇浓度为考察因素，采用正交设计实验，优化提取工艺的条件。
根据四因素三水平可安排因素水平表：
因素水平表
水平
因素
pH值
（A）
浸提温度（°
C）
（B）
浸提时间（h）
（C）
乙醇浓度（%）
（D）
1
4
35
0.5
55
2
7
1.5
75
3
10
85
95
2.4茶多糖的含量测定
2.4.1葡萄糖标准溶液的制备
精密称取105°
C干燥得到的恒定无水葡萄糖对照品10mg，置500ml容量瓶中，稀释到刻度，摇匀，即得。
2.4.2标准曲线的制备
精密量取已配制的葡萄糖标准对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m1分别置于10ml试管中，各用蒸馏水补到2.0ml，空白管吸取蒸馏水2.0ml，与供试品管作以下同步处理。
按苯酚-硫酸法测定的最佳条件[16]，在冰浴中加入1.0ml浓度为5%的苯酚溶液，混匀，迅速滴加浓硫酸7.5mL，摇匀，室温放置15min，然后置冷水中冷却30min显色，在490nm波长处测定吸光度。
以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标作标准曲线及回归方程。
2.4.3茶多糖的含量测定
（1）茶多糖含量的测定与计算
精密吸取定容后的粗多糖溶液适量，加蒸馏水至2.0ml，用回归方程计算待测样品溶液中葡萄糖的浓度，按下式计算样品中茶多糖的含量[17]：
茶叶中茶多糖的含量=茶多糖提取率×
粗提取物中茶多糖的含量
（2）重现性实验
分别吸取定容后溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.5ml、0.4ml，制备不同浓度下的粗多糖溶液，补水至2.0ml后，按照上述2.4.2中的方法分别测定吸光度（A），计算含量，考察茶多糖含量测定的重现性。
（3）稳定性试验
精密吸取同一样品溶液1.0ml按照上述2.4.2中的方法测定吸光度（A），每隔1h测定一次，连续4h，考察茶多糖含量测定的稳定性。
3结果与分析
3.1单因素实验结果
3.1.1pH值对茶多糖提取率的影响
不同pH值条件下茶多糖的提取率见表1，pH值对茶多糖提取率的影响见图1
表1不同pH值条件下茶多糖的提取率
茶多糖的提取率
（%）
5.83%
5.03%
4.64%
3.86%
12
3.28%
图1PH值对茶多糖提取率的影响
本文重点探讨了pH值对茶多糖提取率的影响，由图1可知，pH值对茶多糖提取率的影响较为显著，随pH值升高，茶多糖的提取率呈现下降的趋势，酸性条件下茶多糖的提取率更高，而碱性条件下茶多糖的提取率较低，因此引发了我们对茶多糖糖苷键水解条件的探讨。
3.1.2浸提温度对茶多糖提取率的影响
不同浸提温度下茶多糖的提取率见表2，浸提温度对茶多糖提取率的影响见图2
表2不同浸提温度下的茶多糖提取率
浸提温度
（°
3.45
45
3.74
4.62
65
4.46
4.59
5.04
6.46
图2浸提温度对茶多糖提取率的影响
由上图2可知，在35°
C-55°
C水平，随浸提温度的提高，茶多糖提取率迅速上升，但在65°
C及75°
C条件下，茶多糖提取率增长率不大，而从75°
C-95°
C，茶多糖提取率又迅速上升。
据日本蓑和田博士的专利记载[18]，85°
C以上热水浸提可破坏茶多糖中降血糖的有效成分，故茶多糖提取温度不应超过85°
3.1.3浸提时间对茶多糖提取率的影响
不同浸提时间下茶多糖的提取率见表3，浸提时间对茶多糖提取率的影响见图3
表3浸提时间对茶多糖提取率的影响
浸提时间
（h）
3.12
3.62
4.70
4.74
5
4.90
图3浸提时间对茶多糖提取率的影响
由上图3可知，在0.5h-1.5h水平，随着时间的延长，茶多糖的提取率迅速上升，但从1.5h-5h，茶多糖的提取率呈现平台趋势，上升很缓慢。
由此可见，茶多糖的浸提时间宜使用1.5h。
3.1.4乙醇浓度对茶多糖提取率的影响
不同乙醇浓度下的茶多糖提取率见表4，乙醇浓度对茶多糖提取率的影响见图4
表4不同乙醇浓度下的茶多糖提取率
乙醇浓度
2.35
2.89
3.21
4.82
4.98
5.15
图4乙醇浓度对茶多糖提取率的影响
由图4可知，在乙醇浓度为45%-75%水平，随乙醇浓度的增加，茶多糖的提取率迅速上升，但从75%-95%，茶多糖的提取率呈现平台趋势，基本没有多大变化。
由此可见，提取茶多糖的乙醇浓度宜使用75%。
3.2正交实验结果与分析
3.2.1正交实验数据记录
表5正交试验表设计
表6正交实验组数据
实验组
粗茶质量（g）
茶多糖质量（g）
茶多糖的提取率（%）
20.60
1.26
6.12
20.43
1.23
6.02
20.49
0.83
4.05
20.77
0.84
4.04
20.24
0.78
3.85
6
20.19
0.99
20.79
1.37
6.59
8
20.53
1.30
6.33
9
20.64
1.27
6.15
表7正交实验组提取过程状态记录
提取中溶液的颜色
过滤情况
蒸发浓缩情况
淡红棕色
易过滤
易浓缩
棕绿色
不易浓缩
棕黑色
难过滤
难浓缩
墨绿色
深棕绿色
由表7可知，茶多糖提取过程中，在偏酸性条件下，易过滤和浓缩，提取比较容易；
对于碱性条件下，难过滤和浓缩，提取比较困难；
而中性条件下，提取难易程度介于两者之间。
故得出结论，酸性条件下，茶多糖比较容易提取分离。
3.2.2正交试验数据分析
表8L9（34）正交实验设计及极差分析
实验号
K1
16.75
16.19
17.35
16.12
K2
16.20
12.79
16.21
17.51
K3
15.10
19.07
14.49
14.42
k1
5.58
5.40
5.78
5.37
k2
5.4
4.26
5.84
k3
5.03
6.36
4.83
4.81
极差R
0.55
2.10
0.95
1.03
主次顺序
B>
D>
C>
A
优水平
A1
B3
C1
D2
优组合
A1B3C1D2
由表8分析可知，影响茶多糖提取的最显著因素为B，即浸提温度，其次为乙醇浓度、浸提时间、pH值，在综合影响因素中pH值则为最不显著因素；
在单因素的各水平上分析得到pH值的优水平为pH值为4时，浸提温度的优水平为温度85°
C时，浸提时间的优水平为时间0.5h时，乙醇浓度的优水平为浓度75%时，即最佳提取条件组合为A1B3C1D2，但茶多糖提取工艺的最佳条件组合得综合正交试验与单因素实验以及实际工艺情况考虑。
3.3茶多糖含量的测定
3.3.1葡萄糖标准曲线的绘制
表9葡萄糖溶液的浓度与吸光度的关系
葡萄糖溶液的浓度
（ug/ml）
吸光度
0.139
0.273
0.396
0.529
0.637
图5葡萄糖溶液的标准曲线
由图5可知，葡萄糖标准曲线线性回归方程为：
A=0.0626C+0.0192，R2=0.9988。
其中A为吸光度；
C为葡萄糖溶液浓度（ug/ml）。
该标准品在2.0-10.0μg/ml范围内，标准曲线线性良好，从而由该回归方程式可以准确的计算茶多糖的含量（以葡萄糖计）[19]。
3.3.2茶多糖的含量测定
经上述茶多糖的提取分离，随机取茶多糖提取率为6.02%组的粗多糖，进行茶多糖含量测定实验，精密称取适量的粗多糖20mg定容至500ml。
3.3.2.1重现性实验
分别吸取定容后溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.5ml、0.4ml，制备不同浓度下的粗多糖溶液，补水至2.0ml后，按照上述2.4.2中的测定条件，分别测定吸光度（A），并计算茶多糖的含量，考察茶多糖含量测定的重现性。
表10重现性实验结果
序号
粗多糖的浓度
（mg/ml）
0.020
0.016
0.012
0.010
0.008
0.596
0.464
0.339
0.301
0.240
粗多糖中茶
多糖的含量
46.1
44.4
42.6
45.0
44.1
6.02%
由表10可知，茶多糖含量测定的重现性分析，得知粗多糖中茶多糖的平均含量为44.4%，RSD=2.87%（n=5），则茶叶中茶多糖的含量为44.4%×
6.02%=2.67%，其含量测定的重现性比较好。
3.3.2.2稳定性实验
吸取定容后的上述粗多糖溶液1.0ml，补蒸馏水至2.0ml，按照上述2.4.2中测定条件测定吸光度，并进行茶多糖的含量测定的稳定性分析，测定结果如下：
表11稳定性实验结果
测定时间间隔
0.590
0.589
0.586
0.585
由表11可知，对茶多糖含量测定进行稳定性分析，说明茶多糖的含量测定在4h内基本稳定。
4问题与讨论
4.1pH值影响因子的讨论
单因素试验中，pH值对茶多糖的影响较为显著，从中我们得到，酸性条件时，茶多糖的提取率升高；
碱性条件时，茶多糖的提取率反而下降。
而pH值对茶多糖提取率的影响是本文重点讨论的因子，所以本文就pH值对茶多糖糖苷键水解的影响进行了相关推论：
酸性条件对茶多糖糖苷键的水解不但不促进反而抑制其水解，从而促使茶多糖的提取率升高；
碱性条件对茶多糖糖苷键的水解起到了促进作用，促进了茶多糖的水解，从而促使茶多糖的提取率下降。
4.2浸提温度影响因子的讨论
单因素试验中，浸提温度为85°
C时，茶多糖的提取率达5.04%。
当浸提温度较低时，溶质的渗透能力和溶解能力较低，不利于多糖浸出，从而导致多糖的提取率较低。
茶多糖的热稳定性较差，当浸提温度过高时，其中部分成分使大分子多糖的糖苷键断裂造成多糖的部分损失。
王秀萍等[20]的单因素试验表明，70-80°
C的浸提温度有利于各茶样中茶多糖的提取及其活性的发挥，温度过高茶多糖的提取率反而下降。
孙秋香等[21]的单因素试验也表明茶多糖的产量在60-70%时较高，而并非温度越高越好。
据日本蓑和田博士的专利记载，85°
4.3浸提时间影响因子的讨论
茶多糖的浸出量一般与浸提时间成正比，但扩散达平衡后，时间即不起作用。
达平衡的时间与溶剂体积、浸提温度有关。
浸提时间过短，多糖不能被充分提取；
浸提时间过长则可能使多糖在长时间的高温作用下发生裂解、氧化而使提取率下降。
李碧婵等[22]的研究表明，在开始一段时间，茶多糖的得率随浸提时间的增加而增加，60min以后，随浸提时间的增加，茶多糖产率下降。
黄杰等[23]的单因素试验中，茶多糖的提取率随浸提时间的延长而增加，并没有出现产率下降的现象，这可能与其选择的浸提温度较低有关。
4.4乙醇浓度影响因子的讨论
乙醇沉淀多糖的主要原理是通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖，几乎适用于所有水溶性多糖。
虽然不同多糖可在不同浓度乙醇的条
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