消毒液消毒效力及有效期验证文档格式.docx
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金黄色葡萄球菌
――
2
大肠埃希菌
3
枯草芽孢杆菌
4
白色念珠菌
7.2设备
表2设备清单
设备名称
设备型号
设备编号
生化培养箱
SHP-080
霉菌培养箱
MJP-150
8验证程序
8.1为了确认消毒剂的消毒效力,通过定量悬浮试验法和表面实验法进行验证试验。
1)中和剂的选择:
通过该试验,确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用,对试验用菌及其恢复期培养是否有害或不良影响。
菌种:
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。
消毒剂的配制浓度:
乙醇溶液配制成75%的浓度、新洁尔灭配制成0.1%的浓度、84消毒液配制成0.5%的浓度。
中和剂的选择:
乙醇采用3%吐温80为中和剂,新洁尔灭1%的卵磷脂+0.1%吐温80为中和剂,84消毒液采用1.5%硫代硫酸钠为中和剂。
3%吐温80配制方法:
取吐温803.0ml,加纯化水至100ml,121℃高压灭菌15分钟,即可。
1%的卵磷脂+0.1%吐温80配制方法:
卵磷脂1g,吐温800.1ml加蒸馏水至100ml,121℃高压灭菌15分钟,即可。
1.5%硫代硫酸钠配制方法:
取硫代硫酸钠1.5g,加纯化水稀释至100ml,121℃高压灭菌15分钟,即可。
进行中和剂选择试验时需设置平行6组实验:
第一组消毒剂+菌悬液;
第二组(消毒剂+菌悬液)+中和剂;
第三组中和剂+菌悬液;
第四组(消毒剂+中和剂)+菌悬液;
第五组0.9%氯化钠溶液+菌悬液;
第六组稀释液+中和剂。
●第1组
目的:
观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。
操作方法:
吸取消毒剂4.5ml于试管内,吸加0.5ml菌悬液(含菌量为1×
108cfu/ml~5×
108cfu/ml),混匀。
作用10分钟,吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀。
吸取该最终样液0.5ml,接种于平皿中,做活菌培养计数。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA培养基;
白色念珠菌用SDA培养基。
●第2组
观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。
吸取消毒剂4.5ml于试管中,加0.5ml菌悬液,混匀,作用10分钟,吸此样液0.5ml,加于含4.5ml中和剂溶液管中,作用10分钟,吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀,吸取该最终样液0.5ml,接种于平皿中,做活菌培养计数。
●第3组
观察中和剂是否有抑菌性。
吸取中和剂4.5ml于试管内,再吸加0.5ml菌悬液,混匀,作用10分钟,吸取该最终样液0.5ml,用稀释液做10倍系列稀释至10-3,取相应稀释级各0.5ml,分别接种于平皿中,做活菌培养计数。
●第4组
观察中和产物,或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
吸取中和产物溶液(以1份消毒剂加9份中和剂,作用10分钟配制而成)4.5ml于试管内,再吸加0.5ml菌悬液,混匀,作用10分钟,吸取该最终样液0.5ml,用中和产物溶液做10倍系列稀释,稀释至10-3,取相应稀释级各0.5ml,分别接种于平皿中,做活菌培养计数。
●第5组
作菌落数对照用。
吸取稀释液4.5ml于试管内,再吸加0.5ml菌悬液,混匀,作用10分钟,吸取该最终样液0.5ml,用稀释液做10倍系列稀释至10-3,取相应稀释级各0.5ml,分别接种于平皿中,做活菌培养计数。
●第6组
作为阴性对照用。
分别吸取稀释液与中和剂各0.5ml于同一无菌小平皿内,倒入上述试验同批次的培养基15ml~20ml,培养观察。
如出现细菌生长,可能提示试验材料或操作过程中有污染,应重新进行试验。
样品培养:
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于30~35℃培养3天,白色念珠菌于20~25℃培养5天,培养结束后点计菌落数。
结果判定:
第6组无菌生长
第3、4、5组有相似菌落数生长,其每组间菌落数误差率不超过15%,计算公式如下:
第1组无菌生长或仅有少数试验菌菌落生长
第2组菌落数比第1组菌落数多,但比第3、4、5组菌落数少,且符合下表要求
表3
第1组平板平均菌落数
>5
x
>(X+5)
y
>(y+0.5y)
以上条件均符合要求时,判断所选中和剂及其浓度合格。
2)定量悬浮试验
试验目的:
通过浸泡或液封消毒的消毒剂应通过定量悬浮试验,确定其消毒效力是否符合要求。
操作:
将含菌量为1×
108~5×
108cfu/ml的菌悬液0.5ml加入到10ml的消毒剂溶液中,作用5分钟、10分钟、15分钟、20分钟后,取消毒剂与细菌混合样品0.5ml,接种于4.5ml中和剂中,中和10分钟后,10倍稀释稀释至10-4,取各稀释级1ml分别接种于平皿中,每个浓度平行2个平板。
阳性对照以0.9%氯化钠溶液代替消毒液,同法操作。
结果计算:
计算试验组和对照组的活菌浓度(cfu/ml),并换算为对数值(N),并按下式计算杀灭对照值
杀灭对数值(KL)=对照组平均活菌浓度的对数值(NO)-试验组活菌浓度对数值(NX)
可接受标准:
杀灭对数值(KL)应不低于3~5个对数单位。
3)表面试验法
通过擦拭消毒的消毒剂应通过表面试验法,确定其消毒效力是否符合要求。
染菌不锈钢载片制备
将经灭菌的载片平铺于无菌平皿内,滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌,含菌量为1×
108cfu/ml的菌悬液0.1ml,并均匀涂布于整个载体表面。
滴染菌液后,载片置超净工作台晾干后备用,每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。
染菌玻璃载片制备
因培养皿的材质为玻璃,故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。
进行菌液滴染前,用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积(50mm×
50mm),标注清晰,菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。
操作
●试验组:
将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上,消毒剂作用时间分别为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟,作用结束后,用接触碟取样,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA接触碟取样,白色念珠菌用SDA接触碟取样。
接触碟取样方法:
打开接触碟盖,使培养基表面与取样面直接接触,均匀按压接触碟,确保培养基表面与取样表面均匀接触10秒左右,再盖上碟盖。
●对照组:
对照组的活菌浓度计数见表9菌落计数表。
●阴性对照:
用接触碟在已灭菌未染菌的载片上按压取样,操作同上,每种载片及每种接触碟平行制备两个平皿。
4)模拟现场消毒实验
擦拭区域:
微生物检验室不锈钢工作台面、墙面、超净工作台的台面三个区域的表面微生物取样进行擦拭取样。
擦拭方法:
清洁消毒前取灭菌的棉签1支,用灭菌的纯化水浸湿,握住棉签柄,在取样点处选择约25cm2取样面上,以30°
角与取样表面接触,纵向缓慢并充分擦拭,反转棉签,同法横向擦拭,然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于装有20m灭菌纯化水的瓶中,迅速封口,作为供试液。
实验结束后操作人员按《微生物检验室清洁消毒管理程序(SOP-025)》对洁净区进行清洁消毒,清洁消毒完毕15分钟后,再用灭菌的棉签按以上方法对以上区域进行擦拭。
每个测试点的瓶子均振摇3分钟,使微生物充分释放。
取以上各瓶供试液分别用0.22um的滤膜全部过滤,过滤完毕取出滤膜菌面朝上贴于TSA培养基平板上,30~35℃培养3天,点计菌落数。
≤25cfu/25cm2。
8.2消毒剂有效期确认试验
1)试验目的:
通过该试验,确定消毒剂在有效期内是稳定的,并且消毒效力不会变化,符合要求。
2)试验操作:
配制75%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.5%84消毒液
8.3验证记录:
见表4至表10。
表4中和剂选择实验结果
消毒剂
菌种
稀释度
结果
3、4、5
组间误差率
结论
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
第六组
新洁尔
灭液
金黄色
葡萄球菌
大肠
埃希菌
枯草
芽孢杆菌
白色
念珠菌
乙醇
溶液
84
消毒液
操作人/日期:
复核人/日期:
表5消毒剂定量悬浮试验结果
菌种
稀释级
杀灭
对数值
试验组活菌浓度对数值
0.1%新洁尔灭
10-1
10-2
10-3
10-4
75%乙醇
结论:
。
0.5%84消毒液
表6表面试验法试验记录
不锈钢载片
玻璃载片
对照组
阴性对照组
①
②
金黄色葡萄球
0.5%84消毒液
复核人/日期:
表7模拟现场消毒实验记录(清洁消毒前)
测试点
菌落数
判定标准
结论
微生物检验室不锈钢工作台面
微生物检验室墙面
微生物检验室超净工作台台面
表8模拟现场消毒实验记录(清洁消毒后)
表9菌种信息
菌种信息
菌种名称:
菌种编号:
菌种代数:
菌种来源:
领用日期:
领用人:
稀释至含菌量小于100cfu
表10菌落计数表
菌液名称
10-5
10-6
10-7
10-8
菌落数