常用植物香料提取液对黄曲霉抑制效果的研究毕业论文Word文档下载推荐.docx

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2.ThesolidcultureinhibitioneffectofessentialoilonthegrowthofAspergillusflavushassignificantinhibitoryeffect.

3.CuminoilalsohasasignificanteffectonAspergillusmyceliamorphology,thecellsarescarce,thedisorderofcellmorphology,seriousdeformation,twist.

4.CuminessentialoilonthegerminationofAspergillusflavusspores.

Thecontrolgroupofgermtubeextension,partoftheformationofmycelium.TheexperimentalgroupofAspergillusflavussporesgerminationandnopipe,sporesizewassmallerthanthecontrolgroup;

resultsshowedthatessentialoilcansignificantlyinhibitthegerminationofAspergillusflavusspores,andhaveadamagingeffectonthespore.

KEYWORDS：

cuminessentialoil,GC-MS,Aspergillusflavus,inhibition,diametergrowth,mycelium,sporegermination

1前言

1.1黄曲霉及黄曲霉毒素的概述

黄曲霉是半知菌类，一种常见腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。

菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。

菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。

营养菌丝具有分隔；

气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗（一般为双层），小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。

分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。

黄曲霉毒素（AFT）是主要由黄曲霉（aspergillusflavu）寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素,可分为B族和G族两大类。

上世纪60年代，在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关.进一步的调研证明，这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污染，这些研究工作最终使人们发现了黄曲霉（Aspergillus.flavus）产生的有毒代谢物质，黄曲霉毒素（Aflatoxins）。

黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。

产生的黄曲霉毒素主要有B1，B2，G1，G2以及另外两种代谢产物M1，M2。

其中M1和M2是从牛奶中分离出来的。

B1，B2，G1，G2，M1和M2的在分子结构上十分接近。

1.1.1黄曲霉毒素的化学结构

黄曲霉毒素（Aflatoxins），是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素，如图1-1所示。

图1-1黄曲霉毒素的基本结构

1.1.2黄曲霉毒素的理化性质

黄曲霉毒素的相对分子量为312-346。

难溶于水，易溶于油，甲醇，丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚，己烷和乙醚中。

一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速。

在水中溶解度较低，溶于油及一些有机溶剂，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。

其纯品为无色结晶，耐高温，AFB1在一般烹调加工温度下不能将其破坏，其的分解温度为268℃。

紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。

黄曲霉毒素B1在激发波长365nm下会激发出荧光。

1.1.3黄曲霉毒素的毒性

1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。

黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。

在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。

B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。

黄曲霉毒素的毒性极强远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。

当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。

当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。

黄曲霉毒素毒性比砒霜大68倍，仅次于肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。

据悉，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。

一名相关人员介绍说“B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到，其中以花生和玉米污染最严重。

家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。

”黄曲霉毒素具耐热性，一般烹调加工温度不能将其破坏，裂解温度为280℃[1]。

1.2黄曲霉毒素产毒的控制

黄曲霉及其毒素危害巨大，对其产毒的控制方法，一般有生物，化学，物理等方法。

生物控制方面，乳酸菌作为益生菌，在食品防霉去毒的方法已获得应用，这是运用生物控制的一个成功范例；

芽孢杆菌也已经可以从海洋生物中提取并应用于抑制黄曲霉真菌的生长；

黑曲霉因为具有良好的分泌多种降解酶的能力，并且生产的酶制剂、有安全、可靠、不产生毒素的特点，是公认安全（GRAS）的微生物，也是科技工作者用生物控制方法来降解黄曲霉毒素的一种有效微生物。

物理方法中，常见的有见的有紫外线照射法。

紫外线按照波长范围的不同又可分为UVA（365～400nm）、UVB（280～315nm）、UVC（200～280nm）和真空紫外线（100～200nm）4段，不同紫外线对黄曲霉菌产毒抑制作用强弱不同。

化学法中，一般是用农药等化学物质[2]。

1.3孜然研究概况

1.3.1孜然生物学特性及地理分布

孜然,学名孜然芹（cuminumcyminuml.）[3],也称安息孜然，又名安息茴香，伞形科，孜然芹属，一年生草本植物，外形似小茴香。

孜然原产于埃及、埃塞俄比亚，我国新疆、甘肃河西走廊地区有大量种植，前苏联、地中海地区、伊朗、印度及北美也有栽培。

孜然芹喜冷凉气候，较耐旱，适应性强,对土壤要求不严格,一般以沙土壤为好。

目前世界各国马耳他、塞浦路斯、独联体、摩洛哥、阿尔及利亚、伊朗、叙利亚、印度、巴基斯坦、印度尼西亚、土耳其等均有种植。

孜然种子具有强烈的特征香气，为传统的调味香料。

人类使用孜然作为调味料已有二千多年的历史。

孜然主要用于肉制品的调味，除此之外也用于腌渍品、果酱、干酪等制品的调味[4]。

在做汤和炖肉时若加入孜然滋味尤其好，拉丁美洲人烧肉时使用孜然已十分普遍；

近年来美国流行的墨西哥食品其中就是加了孜然的；

对于风靡我国的新疆烤羊肉串来说，孜然更是必不可少的调料。

另外孜然也可以入药，医学上用于兴奋剂、驱风剂、健胃剂、利尿剂、收敛剂以及镇痉药、止血药、调经药等效果显著[5]。

1.3.2孜然精油的研究概况

目前最常用的孜然精油的提取方法主要有超临界CO2萃取、亚临界萃取、水蒸馏法、微波辅助萃取以及有机溶剂萃取法等。

孜然精油是指孜然籽中一类可随水蒸气蒸馏，具有一定芳香气味且能在常温下挥发的油状物质。

孜然精油是一种天然植物香料，具有抑菌、抗氧化、降血糖、杀虫、防癌抗癌等重要功能，已被美国食品药品管理局（FDA）等世界性组织儿认可，用于食品和日常香精香料的加工之中[6]。

姜子涛等（1992）利用水蒸气蒸馏提取孜然精油，得到的孜然精油为有香味、淡黄色的液体，出油率为4.5%[7]。

曾家豫等（2008）采用水蒸气蒸馏法提取孜然精油,研究了提取时间对精油得率的影响，结果发现，蒸馏3h，挥发油得率达到最大值[8]。

阎建辉等（2002）用GC-MS分析了水蒸气蒸馏得到的孜然精油，鉴定了其中的49种挥发性化学成分[9]。

侯旭杰等（2006）采用水蒸气法结合有机溶剂提取孜然精油，发现比单独采用水蒸气法提取的孜然精油的得率要高。

库尔班江·

巴拉提（2011）研究同时蒸馏萃取法提取新疆孜然精油的提取工艺，在最佳提取工艺条件下，孜然精油的萃取得率为2.71%，同时对孜然精油进行物理化学分析，表明孜然精油性质稳定，且具有非常高的应用价值。

刘志勇等（2002）利用微波辅助技术测定孜然籽中精油的含量。

结果发现，采用微波辅助技术提取孜然精油，不但速度大大加快，而且精油的得率达到了4.86%[10]。

杨艳等（2009）研究运用微波无溶剂蒸馏法提取孜然精油的工艺。

结果发现，最佳工艺条件为：

浸泡时间0.5h、微波功率200W、提取时间45min，在此条件下精油提取率为2.461%[11]。

国内外对孜然的研究报道主要集中在孜然籽挥发油上、孜然微胶囊和孜然油树脂等工业化产品的开发，有研究表明，孜然挥发油有着广泛的抑菌和抗氧化的能力。

1.3.3孜然精油的抑菌活性研究概况

国内外对孜然精油的抑菌活性做了许多的研究，发现孜然精油都具有优良的广谱抑菌活性。

韩建华等（2002）研究的结果表明孜然提取物的浓度为0.19g/mL时能完全抑制小麦的赤霉病菌（Gibberellazeae）和辣椒病菌（Phytophthoracapsicileaonian）的生长[12]。

李伟等（2008）对孜然精油抑菌活性进行了初步的研究，发现孜然精油对米曲霉、黑曲霉、根霉、枯草芽胞杆菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌有很强的抑制作用[13]。

索菲娅等（2006）研究孜然精油、孜然水提物、孜然醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的抑制效果。

结果表明，这几种提取物表现出不同的抑菌能力[14]。

谢喜国等（2011）采用水蒸气蒸馏法提取孜然精油，发现孜然精油有很强的抑菌作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均达到12.5μl/ml[15]。

张应烙等（2003）报道孜然精油对苹果霉心病菌、棉花枯萎病菌、白菜黑斑病菌、小麦纹枯病菌表现出强烈的抑制作用[16]。

1.4本论文研究意义

黄曲霉是一种非常有害的真菌,它严重污染食物并产生黄曲霉毒素导致肿瘤高发.因微生物生长而引起食品变质是事关国民生命安全和健康的大事。

我国是一个人口大国，食品需求量巨大，食品的贮藏、防霉保鲜是食品工业所面临的重大课题。

日前，我国食品贮藏中广泛使用的脱氧保鲜剂成本贵，时效短，即使使用毒性小、污染小的高效而广泛的新一代化学防腐剂也仅起抑制而无脱毒作用，食品安全卫生任务艰巨，形势严峻。

鉴于化学防腐剂使用条件所限、长期使用会产生生物抗药性和累积性毒害等缺点，目前人们已将目光转向从生物中寻找天然抗菌活性成分（如香精油）作为防腐剂并已成回归自然的时尚。

天然防腐剂副作用小，时效长且快。

本研究选取常用植物香料孜然为材料，多角度观察其提取液对产毒黄曲霉的抑制效果，初步探讨该提取液抑制黄曲霉的过程及机理。

1.5本课题的研究内容

（1）采用传统水蒸馏法提取孜然种子中的精油。

将油水直接分离或用旋转蒸发仪将溶剂出去。

（2）采用亚临界萃取法提取孜然精油，提取率较传统方法高，且纯度较高。

（3）运用固体培养即生长速率法（挥发接触）来研究不同方法提取出的孜然精油对黄曲霉生长的影响。

采用滤纸片法测量黄曲霉的生长直径，并且每天在365nm的紫外下观察它的荧光性，看不同方法提取出的孜然精油对黄曲霉生长及产毒能力的影响。

（4）研究其对黄曲霉菌丝体形态的影响。

采用三个平板，两个实验组，一个对照组，培养24h后制片在显微镜下观察其对黄曲霉菌丝体形态的影响。

（5）研究其对黄曲霉孢子萌发的影响。

分别设置两个实验组一个对照组，制片培养每两小时用显微镜观察黄曲霉孢子的萌发状态，并且记录图像，共培养十小时。

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌株

AspergillusflavusCGMCC3.4408购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，PDA培养基4℃保存。

2.1.2培养基及试剂

培养基：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：

马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、β-环糊精12g、蒸馏水1L，自然pH，121℃高压灭菌20min。

　　马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB培养基）：

马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L、自然pH、121℃高压灭菌20min。

试剂：

乙醚：

天津化学试剂厂；

吐温（化学纯）购买于天津市博迪化工有限公司；

四氟乙烷（分析纯）购买于天津市河北区海晶精细化工厂；

生理盐水；

1:

1甘油水。

2.1.3实验仪器与设备

表2-1所需仪器与设备

设备名称

设备型号

生产厂家

1000ml三口烧瓶

蒸馏头

蛇形冷凝管

尾接管

接受瓶

分液漏斗

打孔器

亚临界工艺技术装置

FA2004

常州市特威电气自动化系统有限公司

电子天平

722N

上海精密科学仪器有限公司

电子调温万用电炉

DK-98-Ⅱ

天津市泰斯特仪器有限公司

OPTEC奥特光学生物显微镜

BK5000

重庆奥特光学仪器有限公司

显微镜数码显像系统S/N

T30035813.0MP

西安中显光电科技有限公司

隔水式电热恒温培养箱

PYX-DHS-50X65-BS-II

生物安全柜

BSC-1300A2

上海博讯实业有限公司医疗设备厂

快速混匀器

手提式压力蒸汽灭菌器

YXQ-SG46-28OS

旋转蒸发器

RE-52A

上海亚荣生化仪器厂

2.2实验方法

2.2.1孜然精油的提取

（1）传统水蒸馏法

原料处理方法：

采回后经60℃烘干、粉碎,过60目筛后于一45℃冰箱中保存备用。

精密称取100g孜然粉置于1000ml圆底烧瓶中，加500ml的蒸馏水和几粒沸石，连接好装置，用电加热套对圆底烧瓶进行加热。

（此处为常压蒸馏）料液比为1:

5，温度一般为98℃左右。

共收集水蒸汽馏出液约270ml后停止蒸馏。

用无水乙醚萃取馏出液，每次加乙醚约90ml，萃取三次，（馏出液与乙醚比例为1:

1）将三次乙醚萃取液合并，萃取液以无水硫酸钠干燥后用旋转蒸发仪除去溶剂获得精油。

该精油用于GC-MS分析和抗菌性实验。

（2）亚临界萃取法[17]

采回后经60℃烘干、粉碎，过60目筛后于-45℃冰箱中保存备用。

具体条件:

进料量：

200g

萃取压力：

1.0-1.2mpa

萃取温度：

30-40℃

萃取时间：

60min

2.2.2孜然精油GC-MS的分析[18][19]

样品处理：

各取300μl由水蒸馏得到的精油和由亚临界萃取得到的精油。

GC-MS条件：

（1）色谱条件：

色谱柱：

DB5×

30×

0.25×

0.25（μm）film；

（2）温度：

气化室温度250℃；

（3）程序升温：

40℃（3min）以10℃/min上升到90℃，再以8℃/min上升到250℃（8min）；

进样量0.1μL；

载气：

氦气；

流量：

1ml/min；

分流比60：

1。

（4）质谱条件:

质量范围（m/z）为扫描范围：

30-450amu，电离电压70eV，发射电流：

50微安，接口温度：

250℃，离子源温度：

200℃，电离方式：

EI⁺。

2.2.3菌种活化

①用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿瓶

②用镊子将铝封口打开

③取约0.2mL菌体悬浮液移植于指定的琼脂培养基上，剩余的菌悬液注入指定的液体培养基中（3-4mL），然后在28℃下培养5d，再次接种培养5d完成第二代培养。

2.2.4抑菌测定：

生长速率法（挥发接触法）

实验步骤：

（1）马铃薯培养基（PDA培养基）的配制

（a）配制20％马铃薯培养基取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL。

80℃浸泡1h，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。

121℃灭菌20分钟，即成20％马铃薯浸汁。

（b）配制时，按每100mL马铃薯浸汁加入12gβ-环糊精，2g琼脂，继续加热融化，并补足失水。

（c）高压蒸汽灭菌121℃灭菌20min。

（2）孢子悬浮液的制备：

用2ml左右的无菌生理盐水将黄曲霉斜面上的孢子冲洗下（采用第一代黄曲霉），倒入棕色小瓶，然后放在摇床上震荡，使成团的孢子打散。

（3）设置实验组与对照组，实验组一：

1，2，3号培养皿（三个平行）。

实验组二：

3，4，5号培养皿（三个平行）。

对照组：

6，7，8号培养皿（三个平行）。

（a）将溶化的培养基分别倒入平皿中各20mL，混匀，待凝固。

（b）待培养基凝固后将6mm滤纸片放入培养基中央，每个培养基中放一个滤纸片。

（c）吸取制备好的黄曲霉3.4408孢子悬浮液各10μL分别滴在滤纸片上，倒置。

（d）倒置后，在实验组一培养皿盖上各放入一个滤纸片，在每个滤纸片上滴入200μl由水蒸馏蒸出的孜然精油，实验组二每个滤纸片上各滴入200μl由亚临界萃取得到的孜然精油。

（e）将培养基全部倒置放在28℃下培养。

实验组需在培养皿外包裹几层保鲜膜。

以上操作均在无菌条件下进行。

每隔24h用十字交叉法测量菌落直径，并且在365nm紫外仪下拍照，记录它的荧光性。

培养期为5-7天。

2.2.5孜然精油对黄曲霉3.4408菌丝体形态的影响

观察黄曲霉3.4408菌丝体形态：

（1）将黄曲霉3.4408接种于PDA培养基中，分别设置对照组和实验组一，实验组二。

待培养基凝固后分别在三个平板上滴各10μL黄曲霉3.4408孢子悬浮液，微晃使其分布均匀，28℃培养24h。

培养24h后，采取挥发接触法，在每个培养皿盖上放入一个滤纸片，两个实验组各滴入20μL水蒸馏得到精油及亚临界萃取得到的精油。

（2）继续培养24h后采用棉兰染色法挑取少许菌丝在显微镜下进行观察分析，观察两种不同方法提取出的孜然精油对黄曲霉3.4408菌丝体的影响，同时观察不经孜然精油处理的黄曲霉菌丝体形态，记录并分析图像。

2.2.6孜然精油对黄曲霉3.4408孢子萌发的影响

分别将含由水蒸气蒸馏法得到的孜然精油10μL，亚临界萃取得到的孜然精油10μL和不含精油的培养基加入三个凹槽载玻片的凹槽中，每孔各90μL（包含精油），加精油的培养基中要滴入少量吐温。

再向每孔中接入10μL黄曲霉孢子悬浮液，盖上盖玻片。

置于含一定量甘油水的培养皿中培养。

28℃下培养10h，分别于0、2、4、6、8、10h分别用显微镜分析观察黄曲霉孢子的萌发状态，记录并分析图像。

3结果与讨论

3.1孜然精油提取的结果与讨论

水蒸馏法精油得率计算：

亚临界萃取法精油得率计算：

水蒸馏法是目前最常用的植物精油提取的方法之一。

该方法设备简单、容易操作，适用于在水中溶解度不大的成分的提取，可分为水蒸馏和水蒸气蒸馏两种方式。

水蒸馏是指将植物原料与水按照一定的比例混合后，直接加热蒸馏出精油和水，冷却以后，分离出植物精油。

该方法但在蒸馏过程中植物原料受热焦化，易导致热不稳定成分挥发损失和分解，对有些组分有大的破坏作用，进而影响精油的质量和试验结果。

并且在实验中，将油水混合物分离时用乙醚萃取，萃取后用旋转蒸发仪除去溶剂，整个过程中存在萃取不充分，溶剂除不干净等情况，导致最后精油得率变低。

水蒸气蒸馏法的优点是对实验设备要求不高、易操作、成本较低、产品纯